BmBDV、BmCPV反向遺傳學系統(tǒng)的建立及不同抗性家蠶對BmCPV的感染應答.pdf

1、家蠶濃核病毒(BmBDV)能特異性地侵染家蠶中腸組織的柱狀細胞，是家蠶軟化病的病原。BmBDV的基因組由兩種不同的單鏈DNA，VD1（6,543 nts）和VD2（6,022 nts）構(gòu)成，病毒粒子中只含有兩種DNA分子中的一種。目前還沒有一種細胞系可感染BmBDV，也不能通過基因操作改變 BmBDV的基因研究病毒基因的功能。家蠶質(zhì)型多角體病毒(BmCPV)基因組由10個分節(jié)dsRNA片段組成，每個dsRNA片段含有一個完整的開放閱讀框

2、(ORF)。由于BmCPV為dsRNA，且缺乏BmCPV的敏感細胞系，無法通過基因敲除或敲入研究BmCPV基因功能，導致BmCPV基因功能研究幾無進展。不同的家蠶品種對BmCPV的抗性存在差異，但品種間的抗性差異機制仍有許多不明之處?；谀壳暗难芯楷F(xiàn)狀和存在問題，我們開展了基于BmBDV基因組DNA質(zhì)粒拯救病毒研究、基于體外轉(zhuǎn)錄的病毒 RNA轉(zhuǎn)染細胞拯救BmCPV研究，期望為BmBDV和BmCPV基因的功能研究提供新的系統(tǒng)；同時，利用R

3、NA-Seq技術(shù)，研究了不同抗性品種家蠶感染BmCPV后，中腸組織基因組轉(zhuǎn)錄水平的變化，期望為理解家蠶對BmCPV的感染應答及抗BmCPV的分子機制提供新的線索。
　　1、BmBDV反向遺傳學系統(tǒng)的研究
　　為了提供BmBDV基因功能的研究平臺，將含有BmBDV VD1基因組的重組質(zhì)粒pGEM-VD1轉(zhuǎn)染家蠶卵巢(BmN)細胞，發(fā)現(xiàn)細胞表現(xiàn)出明顯的細胞病變；Western blotting與免疫熒光皆能檢測到BmBDV基因的

4、表達。同時，我們通過Bac-to-Bac載體表達系統(tǒng)構(gòu)建了裝載VD1全基因組的重組桿狀病毒BmBac-VD1，該重組病毒基因組DNA轉(zhuǎn)染BmN培養(yǎng)細胞，可觀察到細胞出現(xiàn)明顯病變，將培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)接正常BmN細胞，表現(xiàn)出相同的病變；Western blotting與免疫熒光試驗可檢測到BmBDV病毒結(jié)構(gòu)蛋白的表達；透射電鏡可同時觀察到球形病毒粒子與桿狀病毒粒子，通過差速離心將兩種病毒粒子分離，分子生物學鑒定結(jié)果顯示，球形病毒樣顆粒中包裹有重組

5、病毒基因組。上述結(jié)果顯示，通過基于病毒基因組的質(zhì)粒DNA可以拯救出BmBDV，通過桿狀病毒裝載VD1全基因組可獲得BmBDV樣的病毒顆粒，表明我們已建立了BmBDV的反向遺傳學系統(tǒng)，為通過基因缺失或突變的方式研究BmBDV的基因功能提供了平臺。
　　2、BmCPV反向遺傳學系統(tǒng)的研究
　　利用片段搭橋和同源重組等方法對BmCPV基因組10個分節(jié)dsRNA片段的全長cDNA進行了克隆，并用T7啟動子分別控制10個分節(jié)dsRNA

6、片段的全長cDNA，克隆進pIZT-V5/His載體，獲得了重組質(zhì)粒pIZT-CS1—pIZT-CS10。同時，用DsRed基因替換BmCPV S10片段cDNA中的多角體蛋白基因的開放讀碼框(ORF)，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pIZT-CS10(DsRed)。
　　以線性化的pIZT-CS1—pIZT-CS10為模板，體外轉(zhuǎn)錄成BmCPV10個基因組片段的RNA，轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細胞，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染細胞表現(xiàn)出發(fā)病癥狀；Western blottin

7、g和免疫熒光能夠檢測到BmCPV基因的表達蛋白；Real-time PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染細胞中BmCPV基因的明顯上升，說明體外轉(zhuǎn)錄的病毒基因組片段的RNA轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細胞可拯救出具有復制能力BmCPV；進而，將BmCPV S1-S9片段的體外轉(zhuǎn)錄RNA與pIZT-CS10(DsRed)為模板的體外轉(zhuǎn)錄RNA共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞，6天后將轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)接正常細胞，轉(zhuǎn)接細胞發(fā)出紅色熒光，隨著培養(yǎng)時間的延長，熒光細胞的比例逐漸增大，說

8、明S10片段為BmCPV復制必須片段，病毒衣殼蛋白識別包埋 S10片段的位點位于非編碼區(qū)。上述結(jié)果表明，通過建立的基于體外轉(zhuǎn)錄的病毒基因組片段的RNA轉(zhuǎn)染家蠶培養(yǎng)細胞拯救BmCPV系統(tǒng)可以用于研究BmCPV的基因功能，可通過將外源基因?qū)隑mCPV基因組的復制非必須片段構(gòu)建重組BmCPV表達外源基因或通過類似策略研發(fā)重組CPV生物殺蟲劑。
　　3、不同抗性家蠶品種感染家蠶質(zhì)型多角體病毒的中腸組織比較轉(zhuǎn)錄組學研究
　　為了探討

9、品種間BmCPV的抗性產(chǎn)生機制，我們通過RNA-Seq測序技術(shù)，比較分析了家蠶藍5(Lan5，BmCPV易感品種）和歐17(Ou17，BmCPV抗性品種）感染家蠶質(zhì)型多角體病毒（BmCPV）后中腸組織的基因表達譜。測序結(jié)果顯示，在感染的Lan5、Ou17中腸組織中，上調(diào)表達基因數(shù)量分別為330和218個，而下調(diào)表達基因數(shù)量分別為147和260個。我們對Lan5與Ou17中腸組織差異表達基因（DEGs）進行了GO（Ontology）富集分

10、析和KEGG（Kyoto Encyclopedia Of Genes And Genomes）富集分析，并利用STRING數(shù)據(jù)庫分析了Lan5與Ou17中腸組織共同上調(diào)/下調(diào)基因的相互作用。結(jié)果顯示，部分共同差異表達基因相互作用并形成網(wǎng)絡，在共同上調(diào)表達基因中，表皮蛋白Cpr62Bc和微型染色體維持蛋白5（DNA復制許可因子Mcm5）的作用至關(guān)重要，而在共同下調(diào)基因中，熱激蛋白23（Hsp23）的作用最為關(guān)鍵。研究結(jié)果為進一步探討家蠶抵