基于IBDV為模型的dsRNA病毒反向遺傳學研究.pdf

1、RNA病毒反向遺傳學的發(fā)展極大地推動了RNA病毒的分子生物學研究和新型疫苗的開發(fā)。dsRNA病毒宿主范圍廣泛,對人或動物造成了重大危害和經(jīng)濟損失。但其反向遺傳學的發(fā)展則遠遠落后于正鏈或負鏈RNA病毒。本研究以雙RNA病毒科的傳染性法氏囊病病毒(IBDV)為模式病毒,就dsRNA病毒的反向遺傳進行探索性研究。
　　 首先克隆了IBDV ZJ2000株基因組B節(jié)段全長cDNA,ZJ2000株基因組B節(jié)段全長為2827bp,在GenB

2、ank(登錄號為DQ166818。ZJ2000株和TL2004株的體內、體外生物實驗表明ZJ2000和TL2004株原代病毒均能直接適應CEF細胞,并引起明顯的細胞病變,ZJ2000株在CEF細胞上的復制速度明顯慢于弱毒株JD1株和HZ2株,TL2004株對9-11胚齡的SPF雞胚和sPF雞均有較強的致病性。對GenBank數(shù)據(jù)庫中雙RNA病毒進行生物信息學分析,在國內外首次發(fā)現(xiàn)雙RNA病毒科中IBDV和IPNV各自的基因組重配現(xiàn)象,并

3、在國內外首次提出雙RNA病毒基因組重配模型。IBDV基因組重配毒株說明IBDV的毒力除VP2外,多重因素可以影響IBDV的毒力,尤其是B節(jié)段在決定毒力方面扮演著重要角色。
　　 以IBDv為模型,應用重疊PCR法在IBDV基因組A、B兩節(jié)段的5’末端和3’末端分別引入具有自我剪切功能的核酶HamRz和HDV序列,分別克隆到PCI真核表達載體當中,構建真核載體PCI-ma和PCI-mb,建立并聯(lián)式共轉染的IBDV反向遺傳系統(tǒng),成功

4、實現(xiàn)了以IBDVHZ2株為母毒的IBDV的遺傳拯救。繼而應用紅色和綠色報告基因構建串連式表達載體,該載體含兩個獨立的轉錄單位,結果顯示報告基因串連式載體在同一靶細胞內的共表達情況明顯優(yōu)于兩報告基因共轉染在同一細胞內的表達效率。將IBDV基因組A、B節(jié)段以串連的方式構建到同一載體當中,該載體含兩個獨立的轉錄單位,載體命名為PCI-mab。將PCI-mab轉染細胞進行病毒拯救,其拯救效率比并聯(lián)式拯救效率提高100倍。
　　 以IBD

5、V為模型,應用PCR法在IBDV基因組A、B兩節(jié)段的5’末端和3'末端分別引入T7啟動子和核酶HDV序列,構建T7啟動子控制下的IBDV感染性載體PT-mA和PT-mB。在脂質體介導下將PT-mA和PT-mB共轉染經(jīng)痘病毒vTF7-3預先感染1h的Vero細胞,建立了基于輔助病毒表達T7 RNA聚合酶的IBDV反向遺傳系統(tǒng),成功實現(xiàn)了以IBDV HZ2株為母毒的IBDV的遺傳拯救。
　　 以IBDV為模型,成功實現(xiàn)了不依賴輔助病

6、毒、借助表達T7 RNA聚合酶的細胞系的dsRNA病毒的遺傳拯救。分別從原核表達菌株BL21工程菌基因組和痘病毒VTF7-3基因組中克隆T7 RNA聚合酶基因,結果顯示克隆的基因同源性為100％。將T7 RNA聚合酶基因構建到逆轉錄病毒載體pLPCX中,經(jīng)包裝細胞PT67包裝后得到具有感染性而不具有自我復制功能的假病毒顆粒JVT7,再將假病毒顆粒JVT7感染Vero細胞,經(jīng)嘌呤霉素篩殺,建立了表達T7 RNA聚合酶的細胞系V-T7,并用