BmCPV編碼的microRNA鑒定及其RDRP基因的dsRNA干擾研究.pdf

1、家蠶質(zhì)型多角體病毒(Bombyx mori Cytoplasmic polyhedrosis virus，BmCPV)病，是家蠶的一種腸道型病毒病，在養(yǎng)蠶生產(chǎn)上具有較大的危害性，病原是一種具包涵體的多角體病毒。研究家蠶質(zhì)型多角體病毒編碼的microRNA（miRNA）和RNA干涉（RNA Interfering，RNAi），一方面從miRNA途徑探明病毒與宿主的免疫調(diào)控關(guān)系，從而找到miRNAs調(diào)控病毒的靶點；另一方面探索RNAi干擾病

2、毒復(fù)制的可行性，對于家蠶病毒病的分子治療乃至抗病品種的育成具有重要的理論和實際意義。本研究預(yù)測了BmCPV編碼的miRNAs，對其中的兩條進行了生物信息學(xué)分析、鑒定和表達特征檢測，初步探索了對病毒本身基因表達的影響；同時研究了雙鏈短RNA（簡稱dsRNA）對BmCPV-RDRP基因的干擾作用，構(gòu)建了表達dsRNA的轉(zhuǎn)基因載體。通過本文研究，為進一步探索miRNAs與家蠶基因組互作的關(guān)系，miRNAs影響宿主的基因的表達，miRNAs與B

3、mCPV病毒各分節(jié)基因相互作用的細(xì)致研究等提供重要的參考價值，同時也為培育抗BmCPV家蠶品種提供了技術(shù)依據(jù)?，F(xiàn)將研究匯報如下。
　　1. BmCPV能夠編碼miRNAs。對感染BmCPV的家蠶中腸組織提取總小RNA，通過深度測序建立了小RNA文庫，預(yù)測獲得BmCPV編碼的miRNAs。對其中的兩條miRNAs進行生物信息學(xué)分析、驗證和表達特征檢測。表明兩條miRNA分別為BmCPV基因組RNA第三片段編碼的miR-3（478～4

4、97 bp）和第五片段編碼的miR-5（2481~2500 bp），大小均為20 bp；在線分析繪制了其二級結(jié)構(gòu)和3-D結(jié)構(gòu)；Stem-loop RT-qPCR和Northern blot兩種方法驗證，確認(rèn)了兩條miRNAs的存在；表達特征檢測進一步表明，miR-3表達量相對較多而miR-5表達較少，家蠶感染BmCPV5 h后能檢測到病毒編碼的miRNAs，24 h后表達量呈上升趨勢。研究結(jié)果表明BmCPV能夠編碼miRNA，為進一步深

5、入研究BmCPV編碼的miRNAs及其功能奠定了基礎(chǔ)。
　　2. BmCPV編碼的miRNAs對病毒本身基因表達具有調(diào)控作用。家蠶感染病毒后體腔注射過量miR和Inhibition-miR，RT-qPCR檢測病毒基因表達，結(jié)果顯示，過量miR能夠顯著促進病毒部分基因表達。
　　3. dsRNA對BmCPV-RDRP基因的干擾作用。以家蠶質(zhì)型多角體病毒依賴于RNA的RNA聚合酶（BmCPV-RDRP）基因為靶標(biāo)，設(shè)計合成三條d

6、sRNA序列，家蠶幼蟲感染病毒后體腔注射dsRNA，RT-PCR檢測靶基因表達。每頭5齡蠶注射4～6 ng/mg劑量的dsRNA，能夠干擾BmCPV-RDRP基因的表達；注射dsRNA后感染病毒的處理區(qū)干擾效率可達93％，而注射dsRNA前感染病毒的干擾效率可達99.9%；同時，檢測BmCPV的二個結(jié)構(gòu)蛋白基因片段（S1、S5），其表達水平隨著RDRP基因表達水平降低而降低，推測dsRNA干擾BmCPV-RDRP基因表達能夠影響病毒的增

7、殖。
　　4.構(gòu)建了表達dsRNA的轉(zhuǎn)基因載體?？寺〖倚Q中腸特異性啟動子P2，構(gòu)建了中間表達載體PBM-P2-dsRNA-eGFP，家蠶細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染和RT-qPCR檢測，結(jié)果表明啟動子P2能夠表達dsRNA而形成shRNA（small hairpin RNA）；以P2-dsRNA序列為目的基因，基于piggyBac轉(zhuǎn)座子構(gòu)建獲得表達 dsRNA的轉(zhuǎn)基因載體pig-P2-dsRNA-ploy(A)-eGFP-neo，家蠶細(xì)胞轉(zhuǎn)染和R