海洋有益菌的篩選、抑菌作用及其在日本對(duì)蝦(Penaeusjaponicus)養(yǎng)殖中的應(yīng)用.pdf

1、青島海洋大學(xué)博士學(xué)位論文海洋有益菌的篩選、抑菌作用及其在日本對(duì)蝦（Penaeusjaponicus）養(yǎng)殖中的應(yīng)用姓名：李會(huì)榮申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：海洋生物學(xué)指導(dǎo)教師：徐懷恕;李筠2001.6.1青島海洋大學(xué)博士學(xué)位論丈 花鱸弧茵病．_ 些礁蓬塾墮·墜：絕堡墮墨蘭墨壘墨! ! ! ! ! 墮2 鰻弧菌胞外產(chǎn)物及致病機(jī)理研究2 ．1 鰻弧菌及其胞外產(chǎn)物的特性分析對(duì)鰻弧菌W ．1 及不同血清型的鰻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株( 0 l ～1 0

2、) 共1 l 株菌株，利用酶底物平板法和血平板法測(cè)定其菌株的各種酶活及溶血活性，結(jié)果表明，這1 1 株菌株均有較強(qiáng)的酪蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、淀粉酶、明膠酶和脂酶活性。W —l有較大的溶血活性，在羊血平板和花鱸血平板均形成明顯的0 ．溶血圈。采用玻璃紙平板法制備1 1 株菌株的胞外產(chǎn)物E C P ，對(duì)其分別進(jìn)行了酶活性及溶血活性的檢測(cè)，結(jié)果表明：除去菌體后的各E C P 仍具有酪蛋白酶、淀粉酶、明膠酶、脂酶活性和溶血活性。2 ．2 鰻弧菌胞外

3、蛋白酶的初步純化以蛋白酶比活力為分析指標(biāo)，比較了對(duì)病原菌w - 1 先鹽析后透析的常規(guī)蛋白質(zhì)提純方法與直接超濾濃縮的提純方法，結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)超濾的蛋白酶比活力為3 7 ．O u ／m gp r ，高于鹽析+ 透析的蛋白酶比活力1 3 ．9 u ／m gp r 。采用S e p h a d e xG ．1 0 0 的柱層析繼續(xù)分離W ．1 ，得到兩個(gè)蛋白峰。利用S D S - - P A G E 測(cè)定蛋白酶活性峰的分子量為3 8 K D

4、。2 ．3 發(fā)酵條件對(duì)鰻弧菌產(chǎn)胞外蛋白酶的影響對(duì)w ．1 在不同液體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)和產(chǎn)蛋白酶曲線的研究表明，兩種液體培養(yǎng)基B H I 和T S B 對(duì)w ．1 有積極地生長(zhǎng)促進(jìn)作用，在2 8 ～4 0 h 內(nèi)，產(chǎn)蛋白酶最多。以T S B 為基本培養(yǎng)基，以蔗糖、蛋白胨、酵母膏、氯化鈉為考察因子，采用四因子三水平正交實(shí)驗(yàn)確定其對(duì)w ．1 菌體生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：蔗糖對(duì)W ．1菌體生長(zhǎng)有積極的正面促進(jìn)作用；培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速顯著影響W ．1 的生長(zhǎng)

5、，高轉(zhuǎn)速( 1 5 0 r ／m i n ) 有利于W ．1 生長(zhǎng)和蛋白酶累積。培養(yǎng)溫度2 0 ℃、2 5 ℃均比3 7 ℃對(duì)w ．1 生長(zhǎng)更有利，并且累積蛋白酶較多。通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，不僅提高了w —l 的菌體生長(zhǎng)速度，而且大大提高了其胞外產(chǎn)蛋白酶能力。2 ．4 胞外蛋白酶的酶學(xué)特性分析了溫度、p H 及酶抑制劑對(duì)胞外蛋白酶的影響。結(jié)果表明，7 0 “ C 處理1 0 r a i n ，蛋白酶酶活幾乎完全喪失；此蛋白酶較合適的p

6、H 范圍為2 ～5 ；E D T A抑制此蛋白酶活性的7 1 ．6 ％，而S D S 和K M n 0 4 對(duì)酶活影響不大，表明此蛋白酶為金屬蛋白酶( 第四章第三節(jié)的P C R 檢測(cè)也證實(shí)了w ．1 菌株金屬蛋白酶基因的存在) ；對(duì)花鱸的毒性實(shí)驗(yàn)表明，其L D 5 0 為1 1 ．8 p g ／f i s h ；花鱸肌肉注射蛋白酶，導(dǎo)致注射部位紅腫、潰爛。對(duì)其主要組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的電鏡觀察表明，該胞外蛋白酶嚴(yán)重破壞花鱸的肌肉、腸、肝等組

7、織細(xì)胞，花鱸肌肉的肌原蛋白溶解，形成低密度區(qū)域，粗細(xì)肌絲無(wú)法辨認(rèn)，肌節(jié)與肌節(jié)脫節(jié)；破壞腸上皮細(xì)胞，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹腫大，形成空泡區(qū)；肝細(xì)胞內(nèi)線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)溶解形成大量的空泡區(qū)域。最終花鱸的運(yùn)動(dòng)機(jī)能完全喪失和能量代謝紊亂，趨于死亡。3 鰻弧菌快速檢測(cè)方法研究3 ．1 利用間接E L l s A 技術(shù)檢測(cè)花鱸鰻弧菌感染以w ．1 為抗原，制備兔抗血清；利用辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔血清( H R P ·I g G ) 為酶標(biāo)二抗，