青枯菌誘導(dǎo)的馬鈴薯轉(zhuǎn)錄因子類StWRKY8基因的克隆及表達(dá)分析.pdf

1、馬鈴薯一直以來(lái)都是全球性的重要農(nóng)作物，對(duì)于人類具有重要的經(jīng)濟(jì)、食用價(jià)值，而其產(chǎn)量、質(zhì)量受青枯病害的嚴(yán)重制約。針對(duì)青枯病害，至今尚無(wú)化學(xué)藥劑能有效防控，故可以從植物抗病方面來(lái)做研究，以期發(fā)現(xiàn)更多的防衛(wèi)相關(guān)基因并了解其功能發(fā)揮及機(jī)制特點(diǎn)，為預(yù)防植物病害提供些許理論依據(jù)。
　　本文分別采用傷根灌菌法、5’-RACE(5’末端快速擴(kuò)增)法對(duì)實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行接種和基因序列的克隆。從接種了青枯菌（Ralstonia solanacearum）的馬

2、鈴薯中薯3號(hào)（Solanum tuberosum）中獲得了類StWRKY8基因的cDNA序列，該序列長(zhǎng)度為563 bp，其中包含一個(gè)長(zhǎng)度為258bp的完整開(kāi)放閱讀框，可編碼85個(gè)氨基酸。類StWRKY8基因序列內(nèi)部具有一個(gè)典型的WRKYGQK保守結(jié)構(gòu)域。C2H2為其鋅指結(jié)構(gòu)類型，因此隸屬于WRKY家族中的第二類。經(jīng)由鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建，分析其氨基酸序列發(fā)現(xiàn)與茄科內(nèi)的（Solanaceae）其他成員具有較高程度的同源性，甚至與馬鈴薯轉(zhuǎn)

3、錄因子StWRKY8相似性高達(dá)98％，故命名為類StWRKY8。而類StWRKY8相關(guān)理化性質(zhì)、等電點(diǎn)等則通過(guò)運(yùn)用相應(yīng)的生物信息學(xué)軟件來(lái)預(yù)測(cè)：等電點(diǎn)大約為9.10，半衰期大于5.6 h，屬于親水性蛋白，且親水性較高。三維結(jié)構(gòu)為非球型，含有3個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中兩個(gè)為Ser磷酸化位點(diǎn)，其中一個(gè)為Tyr磷酸化位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)其屬于胞內(nèi)蛋白。經(jīng)青枯菌誘導(dǎo)后，兩種不同材料中類StWRKY8基因的定量分析運(yùn)用RT-PCR和qRT-PCR來(lái)進(jìn)行，

4、結(jié)果顯示：類StWRKY8受青枯菌誘導(dǎo)后表達(dá)量上調(diào)，并且在感、抗病兩基因型馬鈴薯中表達(dá)有較明顯的差異。類StWRKY8基因在抗病基因型馬鈴薯接種青枯菌6h內(nèi)就能高強(qiáng)度的表達(dá)，發(fā)揮其抗性，而在感病基因型馬鈴薯接種青枯菌6h之內(nèi)的表達(dá)較為緩慢，強(qiáng)度也較低，不能在侵染之初很好地抗病。利用地高辛原位雜交手段對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行組織定位后顯示：類StWRKY8基因的表達(dá)主要集中在莖葉組織中，即有維管束、韌皮部的維管束系統(tǒng)中，這說(shuō)明其表達(dá)具有明顯的