嵌套式PCR超靈敏檢測馬鈴薯環(huán)腐病菌.pdf

1、該研究先是應(yīng)用國外成功報(bào)道的根據(jù)存在于pCSI質(zhì)粒和環(huán)腐菌染色體中一個1.3kb的插入因子IS1121、高度重復(fù)的DNA片段設(shè)計(jì)的環(huán)腐病菌亞種特異引物序列合成出引物對CMSIF-1-CMSIR1和引物對CMSIF2-CMSIR2.由于引物對CMSIF1-CMSIR1和引物對CMSIF2-CMSIR2序列中的G、C的含量較高,在反應(yīng)體系中適當(dāng)加入甲酰胺,比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果甲酰胺可大大降低錯配率,提高了特異性片段的產(chǎn)量.分別以環(huán)腐菌基因組DNA和

2、菌懸液為模板進(jìn)行直接PCR,結(jié)果表明以菌懸液為模板仍可同樣得到特異性片段(直接PCR以引物對CMSIF1-CMSIR1擴(kuò)增出1046bp的片段,這個結(jié)果大大簡化了提取細(xì)菌基因組DNA的步驟.分別以環(huán)腐菌菌懸液和直接PCR產(chǎn)物為模板應(yīng)用嵌套式PCR中的引物對CMSIF2-CMSIR2進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果表明只有經(jīng)過直接PCR擴(kuò)增嵌套式PCR擴(kuò)增才有特異性產(chǎn)物產(chǎn)生.以環(huán)腐標(biāo)準(zhǔn)菌株、黑龍江省環(huán)腐菌株以及馬鈴薯上其它主要的細(xì)菌病原菌(青枯病、軟腐病、

3、黑脛病)為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行直接PCR和嵌套式PCR擴(kuò)增,結(jié)果只有環(huán)腐標(biāo)準(zhǔn)菌株和黑龍江省環(huán)腐菌株出現(xiàn)特異性片段(直接PCR擴(kuò)增出1046bp的片段,嵌套式PCR擴(kuò)增出864bp的片段).將環(huán)腐菌純菌種菌懸液稀釋成濃度梯度并與馬鈴薯組織液混合進(jìn)行直接PCR和嵌套式PCR檢測靈敏度比較,結(jié)果表明嵌套式PCR檢測靈敏度比直接PCR檢測靈敏度提高了100-1000倍,同時與間接ELISA方法檢測靈敏度進(jìn)行了比較.以明顯病癥狀的塊莖、無明顯感病癥狀的塊