甘薯抗病相關(guān)基因的克隆與分析.pdf

1、植物抗病基因克隆研究對(duì)于抗病育種和抗病機(jī)制的理解具有重要的意義。甘薯不僅基因組龐大，且重復(fù)序列含量豐富，這些特點(diǎn)使得利用經(jīng)典基因克隆方法克隆甘薯抗病相關(guān)基因極其困難。目前，已經(jīng)從10多種植物中分離到將近60多個(gè)針對(duì)細(xì)菌、真菌、線(xiàn)蟲(chóng)和病毒的抗病基因，但尚未有功能性甘薯抗病基因被克隆。雖然這些抗病基因各具特點(diǎn)，但是它們大多數(shù)具有保守的結(jié)構(gòu)域，如NBS、LRR等，這為甘薯抗病基因的克隆研究提供了新的思路。 除抗病基因外，植物對(duì)病害防衛(wèi)

2、反應(yīng)的另一種作用方式是植物防衛(wèi)反應(yīng)信號(hào)蛋白編碼基因，如NPR1。NPR1基因是調(diào)控植物對(duì)病害防衛(wèi)反應(yīng)的一個(gè)關(guān)鍵基因。它不僅對(duì)植物系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance，SAR)和誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance，ISR)起核心調(diào)控作用，而且是植物基礎(chǔ)抗性(basic resistance)以及由抗病基因(resistance．gene，R)決定的抗性的重要調(diào)控因子。其過(guò)

3、量表達(dá)可提高寄主對(duì)多種病害的抗性。已發(fā)現(xiàn)一些重要作物中都存在NPR1及其類(lèi)似基因，NPR1及其類(lèi)似基因介導(dǎo)的抗性可能是多種植物共同的保守途徑。因此，NPR1及其類(lèi)似基因在植物抗病基因工程中具有廣泛的應(yīng)用前景。 本論文主要研究?jī)?nèi)容包括：(1)根據(jù)其抗病基因保守結(jié)構(gòu)域(P-loop和GLPL)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，以高抗根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病的甘薯栽培品種青農(nóng)2號(hào)和近緣野生種三淺裂野牽牛基因組DNA為模板，用PCR擴(kuò)增甘薯及三淺裂野牽牛NBS類(lèi)抗病基因

4、類(lèi)似物(resistance gene analogues，RGAs)，并對(duì)RGAs序列進(jìn)行分析，揭示甘薯抗病基因的多樣性、起源與進(jìn)化關(guān)系；(2)以分離的甘薯RGAs序列為基礎(chǔ)，用RT-PCR和RACE(Rapid amplification eDNAend)方法分離甘薯NBS-LRR抗病相關(guān)基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)所獲得的全長(zhǎng)基因進(jìn)行Southern雜交分析和初步的轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測(cè)； (3)根據(jù)已克隆的擬南芥、煙草等植物NPR1基因的

5、保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR和RACE方法分離到甘薯NPR1類(lèi)似基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)所獲得的全長(zhǎng)基因進(jìn)行Southern雜交分析和初步的轉(zhuǎn)錄表達(dá)檢測(cè)。主要研究結(jié)果如下： 1．根據(jù)己知植物抗病基因的保守區(qū)域(P-loop和GLPL)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，共從抗根結(jié)線(xiàn)蟲(chóng)病甘薯品種青農(nóng)2號(hào)和近緣野生種三淺裂野牽牛基因組DNA擴(kuò)增出28條RGAs(其中甘薯22條，分別命名為IbRGA1～I(xiàn)bRGA22；三淺裂野牽牛6條，分別命名為

6、ItRGA1～I(xiàn)tRGA6)，在GenBank網(wǎng)站上的登錄號(hào)分別為DQ251184、DQ272296、DQ272297、DQ303440-DQ303442、DQ341401-DQ341403、DQ341405-DQ341408、DQ377949-DQ377957、DQ849027-DQ849032。序列分析表明，28條RGAs編碼的氨基酸絕大部分含有典型的NBS-LRR類(lèi)抗病基因所共同擁有的保守性結(jié)構(gòu)域P-loop、Kinase-2a、

7、Kinase-3a和疏水結(jié)構(gòu)域(HD)，屬于NBS-LRR類(lèi)抗病蛋白，其中部分還與GenBank中已登錄的馬鈴薯Grol-4基因、番茄Mi-1、Mi-2．Hero、擬南芥RPM1等植物R基因具有很高的相似性，說(shuō)明這些RGAs有可能為甘薯抗病基因部分片段。28條RGA序列之間核甘酸序列間的相似性在35.5％～99.4％之間變化，而相應(yīng)推測(cè)的氨基酸序列間的相似性在13.8％～100％間變化，同時(shí)對(duì)分離的RGAs的核苷酸和氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)

8、育樹(shù)分析，表明可明顯分為T(mén)IR(Drosophila Toll or human interleukin recaptor-like)和nonTIR兩類(lèi)。通過(guò)對(duì)它們密碼子組成與使用、同義替代(synonymous substitution)率(Ks)和非同義替代(non-synonymous substitution)率(Ks)的分析表明，甘薯NBS-LRR類(lèi)RGAs與其他物種NBS-LRR類(lèi)抗病基因可能具有同樣的起源和進(jìn)化機(jī)制。

9、 2．在所分離的RGAs基礎(chǔ)上，采用RACE技術(shù)獲得了全長(zhǎng)3200bp的甘薯抗病相關(guān)基因SPRl，該基因包括2667 bp的開(kāi)放讀碼框，編碼888個(gè)通讀的蛋白質(zhì)氨基酸序列，基因編碼產(chǎn)物具有NBS、LRR、HD等一系列抗病基因的保守結(jié)構(gòu)。Southern雜交結(jié)果表明，SPR1基因在甘薯中具有2-4個(gè)拷貝。RT-PCR技術(shù)對(duì)該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況研究表明，SPR1基因在甘薯中為組成型表達(dá)，其表達(dá)無(wú)組織特異性。初步認(rèn)為甘薯SPR1基因?yàn)閚on

10、TIR-NBS-LRR類(lèi)抗病相關(guān)基因。SPR1基因的編碼產(chǎn)物為抗病相關(guān)蛋白，在結(jié)構(gòu)上與擬南芥RPM1基因具有較高的相似性。目前SPRl基因已在GenBank上注冊(cè)，登錄號(hào)為EF428453。 3．根據(jù)已克隆的其他植物的NPR1基因的保守序列設(shè)計(jì)引物，從甘薯青農(nóng)2號(hào)中獲得了NPR1類(lèi)似基因片段，根據(jù)獲得的基因片段的序列設(shè)計(jì)RACE引物，通過(guò)RACE法獲得了甘薯NPR1的全長(zhǎng)基因cDNA序列，全長(zhǎng)2353 bp，包含1761 bp的

11、開(kāi)放讀碼框，編碼586個(gè)通讀的氨基酸序列。通過(guò)序列分析發(fā)現(xiàn)甘薯NPR1基因推導(dǎo)的蛋白質(zhì)都具有已知NPR1蛋白的典型保守結(jié)構(gòu)域POZ/BTB和ANK。對(duì)已報(bào)道的擬南芥、煙草、番茄、水稻等植物NPR1與甘薯NPR1的氨基酸序列分析表明：對(duì)NPR1功能起關(guān)鍵作用的氨基酸在不同物種不同基因產(chǎn)物間均具有保守性，如nprl-1(H)，nprl-2(c)和nim 1-4(R)。Southern雜交結(jié)果表明，SPR1基因在甘薯中具有1-2個(gè)拷貝。利用半