應(yīng)用DNA微陣列技術(shù)對(duì)洛克沙砷處理肉雞后肝臟和胸肌組織基因表達(dá)譜的研究.pdf

1、DNA芯片又被稱為DNA微陣列(Microarray),這項(xiàng)上世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的新興生物技術(shù),目前已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域.洛克沙砷作為一種人工合成的有機(jī)砷化物,被大量用作動(dòng)物促生長(zhǎng)添加劑添加到畜禽飼料中.為了研究洛克沙砷促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)及其毒性的作用機(jī)制,我們首先建立了絲毛烏骨雞胸肌組織和肝臟組織的2個(gè)cDNA文庫(kù),并經(jīng)大規(guī)模的基因測(cè)序和生物信息學(xué)分析,得到在胸肌組織中表達(dá)的基因6023個(gè),肝臟組織中表達(dá)的基因4839個(gè).我

2、們將兩個(gè)文庫(kù)的非冗余基因10862文庫(kù)中挑出,經(jīng)大量PCR擴(kuò)增、純化和電泳檢測(cè),除去未擴(kuò)增出的序列和含有多條帶的污染序列,最終得到9216條高質(zhì)量的cDNA擴(kuò)增產(chǎn)物,并將這些序列用于DNA芯片的點(diǎn)制.由于影響DNA芯片質(zhì)量的因素很多,為了得到最佳的芯片制作和雜交效果,我們對(duì)影響芯片的各種參數(shù)條件作了進(jìn)一步的優(yōu)化.用SpotBot<'TM>芯片點(diǎn)樣儀對(duì)4種不同的點(diǎn)樣液(3×SSC、50﹪的DMSO、3×SSC+1.5M甜菜堿以及MSP)和

3、5個(gè)不同公司生產(chǎn)的7種芯片片基(UltraGAPS<'TM>、GAPSⅡ、SuperAmine、SuperAmine Barcoded、Baio氨基玻片、PL-100C多聚-L-賴氨酸片和POLY-PREP<'TM>片基)進(jìn)行了比較分析,發(fā)現(xiàn)UltraGAPS<'TM>、GAPSⅡ、 SuperAmine、SuperAmine Barcoded4種片基用3×SSC+1.5M甜菜堿能得到最佳的點(diǎn)樣和雜交結(jié)果.為了探究洛克沙砷促生長(zhǎng)作用的分

4、子機(jī)理,我們將112只3周齡隱性白羽農(nóng)大系肉雞作了4個(gè)分組處理,各組日糖果依次添加45mg/kg、600mg/kg、0mg/kg的洛克沙砷.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),4個(gè)分組在第4、5、6周的單周凈增重和累積凈增重的差異彼此都達(dá)到了顯著水平(p<0.05);累積體重除第4周的300mg/kg組和對(duì)照組之間的差異不顯著外,其余的也都達(dá)到了顯著水平(p<0.05).第4周到第7周的飼料轉(zhuǎn)化效率以45mg/kg料組最高(2.29),對(duì)照組次之(2.3

5、8),再次是300mg/kg料組(2.42)和600mg/kg料組(2.62).該試驗(yàn)說(shuō)明,在肉雞飼料中添加適量的洛克沙砷,可以持續(xù)顯著地加快肉雞的生長(zhǎng)速度,提高肉雞的飼料轉(zhuǎn)化效率;但過(guò)量添加時(shí)則會(huì)顯著抑制肉雞的生長(zhǎng).為了研究洛克沙砷的殘留作用與基因表達(dá)之間的關(guān)系,我們應(yīng)用原子熒光吸收法對(duì)肝臟和胸肌組織以及飼料中的總砷含量進(jìn)行了測(cè)定.對(duì)于適量洛克沙砷能促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)的分子機(jī)理以及過(guò)量洛克沙砷對(duì)肉雞的毒性機(jī)制,我們進(jìn)一步利用DNA芯片進(jìn)行分

6、析.利用我們優(yōu)化的芯片條件,即用SpotArray72型點(diǎn)樣儀將純化的cDNA以Betaine+3×SSC作為點(diǎn)樣液,22℃的點(diǎn)樣環(huán)境溫度,40-45﹪的相對(duì)濕度,用UltraGAPS<'TM>和SuperAmine片基,每個(gè)樣品在每張芯片上點(diǎn)兩個(gè)重復(fù),180μm的點(diǎn)距,24×24亞陣列進(jìn)行芯片的點(diǎn)制.以4~7周對(duì)照組和處理組的肝臟和胸肌作為芯片分析的實(shí)驗(yàn)材料,分別提取完整的總RNA,并將來(lái)自同一處理、同一組織、同一時(shí)間段的總RNA混合

7、成池.以間接標(biāo)記法標(biāo)記和純化探針,然后與芯片雜交,另以反色重復(fù)作為芯片之間的重復(fù).雜交后的芯片用ScanArray4000掃描儀掃描得到雜交圖像,再用QuantArray分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析處理,導(dǎo)出雜交信號(hào)原始數(shù)據(jù),進(jìn)一步對(duì)數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理得到Cy3/Cy5或者Cy5/Cy3的比值.為了對(duì)數(shù)據(jù)作更精確的分析,我們將QuantArray導(dǎo)出的原始分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入GeneSpring芯片專門分析軟件作進(jìn)一步的處理和分析.經(jīng)過(guò)分析得到了芯片上

8、所有基因的聚類圖譜和表達(dá)圖譜,并初步得到了每張芯片上表達(dá)差異的基因.我們首先將來(lái)自肝臟組織和胸肌組織4~6周處理組與對(duì)照組比較雜交的36張芯片進(jìn)行了聚類分析,得到了基因在兩種組織中表達(dá)的聚類圖譜;進(jìn)一步分析得到了所有基因在這36張芯片上的曲線表達(dá)圖譜.通過(guò)同時(shí)對(duì)肝臟組織和胸肌組織基因的聚類和表達(dá)分析,我們可以同時(shí)知道某一特定基因在所有時(shí)間段和所有劑量處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況.另外,我們還分別對(duì)肝臟和胸肌基因表達(dá)的數(shù)據(jù)作了分析,得到了肝臟和胸