含有MDVgB和IL-2重組火雞皰疹病毒的構(gòu)建及其免疫保護(hù)作用.pdf

1、　　馬立克氏病(MD)是由馬立克氏病病毒(MDV)引起的雞的一種高度傳染性、淋巴組織增生性疾病。本文利用HVT作為載體表達(dá)MDVgB和白介素2(IL-2)基因，構(gòu)建了一株重組病毒，并檢測它們對SPF雞抵抗超強(qiáng)MDV(vvMDV)攻擊的免疫保護(hù)作用。　　根據(jù)GenBank發(fā)表的序列及DNAstar軟件分析，選取MDV糖蛋白B(gB)2010bp和雞IL-2477bp目的片段，在Primer5.0軟件的輔助下分別設(shè)計(jì)兩對引物Primer(

2、G1)、Primer(G2)和Primer(I1)、Primer(I2)，并分別在gB引物的5’端加上BglⅡ、3’端加上HindⅢ；在IL-2引物的5’端加上HindⅢ、3’端加上SalⅠ。用PCR方法擴(kuò)增gB和IL-2，將PCR產(chǎn)物分別克隆入pEGFP-C1，構(gòu)建成pC1-gB-IL，將pC1-gB-IL用NaeI+EcoO109I雙酶切，構(gòu)建外源基因表達(dá)盒，并將其克隆入pTK2B載體的TK基因中，構(gòu)建成pT-C-gB-IL重組HV

3、T轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體。　　確定轉(zhuǎn)染時(shí)親本毒的用量，用磷酸鈣共沉淀法將HVT轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pT-C-gB-IL與HVT在CEF細(xì)胞上進(jìn)行同源重組，將目的基因?qū)際VTTK區(qū)。用熒光觀察法連續(xù)篩選10代獲得重組病毒rHVT-gB-IL。通過Western-blotting鑒定，該載體在CEF細(xì)胞中可有效表達(dá)MDVgB和IL-2融合基因，表明重組病毒成功表達(dá)了外源基因片段且融合表達(dá)產(chǎn)物具有免疫原性；親本毒和重組毒的細(xì)胞半數(shù)致死量(TCID50)值基

4、本一致，表明外源基因插入HVTTK后不影響病毒的復(fù)制和生物學(xué)特性?！　∮胷HVT-gB-IL和HVT(商品苗)分別免疫1日齡SPF雞，8日齡時(shí)用MDVRB1B株超強(qiáng)毒攻毒，隔離飼養(yǎng)9周。剖檢飼養(yǎng)期間的死亡雞，檢查并記錄病變，每周每組取2～3只雞采血分離血清以檢測MDV抗體，每只雞采翅部羽毛6根進(jìn)行瓊脂糖擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)(AGP)，9周后撲殺全部剩余試驗(yàn)雞，統(tǒng)計(jì)MD的發(fā)病情況。血液中MDV抗體的檢測結(jié)果是：疫苗免疫后第三周開始，試驗(yàn)雞體內(nèi)MDV