SARS冠狀病毒刺突蛋白S144-643的原核表達(dá)及其重要生物特性研究.pdf

1、嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)又稱“非典型性肺炎”，或“非典”，主要表現(xiàn)為肺炎及漸進(jìn)性呼吸衰竭，死亡率為10％左右。它于2002年11月在中國廣東省首先爆發(fā)，然后迅疾傳播至全球32個(gè)國家及地區(qū)，其病原為一種新的冠狀病毒(SARSassociatedcoronavirus，SARS-CoV)。目前尚無特效藥物用于SARS治療，正在研究的各種抗病毒方法包括：用模擬受體分子或病毒

2、的受體結(jié)合蛋白封閉病毒受體相互作用、用小肽分子抑制病毒與細(xì)胞膜間的融合、用特定中和表位研制亞單位疫苗等。SARS-CoV刺突蛋白S1是與病毒主要受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensinconvertingenzyme2，ACE2)相結(jié)合的病毒蛋白，其受體結(jié)合功能區(qū)包括在第318-510個(gè)氨基酸殘基間的193個(gè)氨基酸片段內(nèi)，該片段同時(shí)包含多個(gè)中和表位。本研究通過克隆表達(dá)SARS-CoV的S1蛋白受體結(jié)合區(qū)，為SARS-CoV受體AC

3、E2功能區(qū)鑒定提供手段；同時(shí)，用所表達(dá)的S1蛋白為靶蛋白，從噬菌體展示隨機(jī)肽庫中篩選特異性結(jié)合多肽，為病毒受體及抗原抗體相互研究及抗病毒研究提供理論依據(jù)。 本論文將S144-643的基因片段(nt430-nt1929)克隆入表達(dá)質(zhì)粒pET-28b中，在大腸桿菌中原核表達(dá)了該段S1蛋白。S1蛋白以組氨酸標(biāo)簽標(biāo)記，蛋白分子量為50KD左右，以包涵體形式存在于細(xì)菌中。Westernblot證明，S144-643可以與SARS康復(fù)病人的

4、陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，免疫新西蘭大白兔可以誘發(fā)產(chǎn)生較高水平的特異性抗體，因而證明原核表達(dá)的S144-643具有良好的免疫原性。同時(shí)Westernblot證實(shí)，S144-643蛋白能與病毒受體ACE2結(jié)合。結(jié)合楊國良ACE2的有關(guān)研究材料，證實(shí)ACE2N端的335個(gè)氨基酸與SARS-CoVS1的結(jié)合相關(guān)。 經(jīng)過His.Bind試劑盒純化的S144-643蛋白作為靶蛋白，從十二肽庫中篩選與其特異性結(jié)合的多肽。經(jīng)過3輪篩選，并經(jīng)過E