siRNA-IP9和siRNA-IP10對(duì)體外大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞IP-9和IP-10表達(dá)的抑制作用.pdf

1、全文分為二部分： 第一部分IFN--,／刺激大Il原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)lip-9和IP．10的檢測(cè) 目的：檢測(cè)大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在IFN-7刺激下產(chǎn)生IP-9和IP—lO的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)量。 方法：采取半原位膠原酶灌注法分離并培養(yǎng)大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，用不同濃度的IFN-7(1ng／ml、10ng／ml、100ng/m1)刺激使其產(chǎn)生IP-9和IP一10，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)1h、12h、24h、48h、7

2、2h收集上清液和細(xì)胞。設(shè)計(jì)合成IP-9和IP—10PCR的引物，用RT-PCR法分別檢測(cè)IP-9和IP一10的mRNA水平表達(dá)量；上清液采用ELISA法，分別測(cè)定IP-9和IP一10的蛋白水平表達(dá)量。 結(jié)果：成功用半原位膠原酶灌注法分離并培養(yǎng)了大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，收集了不同濃度及時(shí)間點(diǎn)IFN-~刺激下的細(xì)胞上清液及細(xì)胞，分別用RT-PCR法和ELISA法檢測(cè)了IP-9和IP一10的．mRNA水平和蛋白水平表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在IFN-7

3、刺激下IP-9和IP一10的mRNA水平表達(dá)量在12h時(shí)最高，蛋白水平表達(dá)量在24h時(shí)最高；并呈濃度依賴關(guān)系，在100ng/mlIFN-7刺激時(shí)表達(dá)量最高。 結(jié)論：成功檢測(cè)了大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞在IFN-7刺激下產(chǎn)生IP一9和IP一10在不同時(shí)間點(diǎn)的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)量。 第二部分siRNA一口9和siRNA-IPlO轉(zhuǎn)染后對(duì)llp．9和IP．10表達(dá)水平的抑制作用 目的：檢測(cè)siRNA-IP9和siRNA

4、-IPlO轉(zhuǎn)染大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞后經(jīng)100ng/mlIFN-~刺激產(chǎn)生IP-9和IP一10的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)量，并評(píng)價(jià)其抑制作用。 方法：體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA-IP9和siRNA-IPlO各四條，經(jīng)ietSITM-FluoF轉(zhuǎn)染大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞后篩選出抑制效果最佳者。將其轉(zhuǎn)染大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)后用100ng／mlIFN-~刺激使其產(chǎn)生IP-9和IP—lO，分別在不同的時(shí)間點(diǎn)1h、12h、24h、48h、72

5、h收集上清液和細(xì)胞。同樣用RT-PCR法分別檢測(cè)IP-9和IP一10的mRNA水平表達(dá)量；上清液采用ELISA法，分別測(cè)定IP-9和IP一10的蛋白水平表達(dá)量。 結(jié)果：RT-PCR及ELISA結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染siRNA-IP9和siRNA-IPlO到大鼠原代肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞后分別對(duì)經(jīng)IFN-~刺激產(chǎn)生的IP-9和IP一10的mRNA水平和蛋白水平表達(dá)均有抑制作用，尤其是IFN-y刺激后48h有最好抑制效果，在mRNA水平抑制率分別是52％