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文檔簡介
1、目的:對河北省腎綜合征出血熱(HFRS)疫區(qū)人感染和鼠攜帶漢坦病毒(HV)進行基因序列測定,通過DNASTAR軟件對兩者進行比較分析,闡明同一地區(qū)鼠攜帶HV與人感染HV二者的病原學(xué)特征及聯(lián)系,為HFRS的防控提供科學(xué)依據(jù)。
方法:
1.通過流行病學(xué)調(diào)查,收集病人或疑似病人急性期血清標(biāo)本;并在相同區(qū)域開展夾夜法捕鼠,無菌取鼠肺;
2.采用間接免疫熒光法(IFA)篩選陽性血清標(biāo)本,從中提取HV RN
2、A;用冷凍切片機切鼠肺,冷丙酮固定后,IFA篩選HV陽性鼠肺;
3.通過反轉(zhuǎn)錄套式聚合酶鏈反應(yīng)(RT-nested PCR)擴增病毒核酸,進行基因分型;從陽性鼠肺中提取HV RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,根據(jù)已知HV標(biāo)準(zhǔn)毒株的基因序列設(shè)計SEO型和HTN型型特異性引物,用RT-nested PCR擴增,進行基因分型;
4.選擇代表性疫區(qū)血清標(biāo)本以及相同地區(qū)鼠肺標(biāo)本PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)純化回收后進行序列測定;
3、 5.利用DNASTAR軟件對人感染的HV及鼠攜帶的HV進行同源比較并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹,并對同一地區(qū)人感染的HV及鼠攜帶的HV進行比較。
結(jié)果:
1.本實驗共收集病人或疑似病人血清標(biāo)本158份,經(jīng)IFA檢測陽性101份,陽性率為63.92%。對陽性血清標(biāo)本進行RT-PCR擴增,得到17份陽性結(jié)果,陽性率為16.83%。
2.對河北省HV陽性病人血清標(biāo)本同時用SEO型和HTN型分型引物進行RT
4、-nested PCR擴增,顯示陽性標(biāo)本所攜帶HV均為SEO型,未發(fā)現(xiàn)HTN型。
3.本實驗從1630份鼠肺中共獲得陽性鼠肺43份,帶毒率為2.64%。從全省各地鼠密度和帶毒率分布情況看,我省HFRS疫源地帶毒鼠主要以宅區(qū)褐家鼠為主,其次為宅區(qū)小家鼠,野外帶毒鼠不是主要傳染源。
4.對陽性鼠肺標(biāo)本總RNA同時用G1片段SEO型和HTN型分型引物分別進行擴增,顯示陽性標(biāo)本所攜帶HV均為SEO型,未發(fā)現(xiàn)HTN型。
5、
5.人感染HV與鼠攜帶HV的G1、G2片段基因變異分析
5.1人感染HV與鼠攜帶HV的G1片段核苷酸同源性比較及基因變異情況
全省各地整體的人感染HV與鼠攜帶HV的G1片段核苷酸同源性比較結(jié)果顯示G1片段核苷酸序列同源性高達95.0%~99.7%。其中SJZ和ffTS為95.0%,CD2、BD1、BD2、BD3和ffSJZ,QHD2、TS和ffQHD,CZ1、CZ2和ffCZ都是99.7%,其
6、余的為95.2%~99.4%之間。同一地區(qū)兩種標(biāo)本的分別為:保定為95.5%~96.4%,承德95.5%~96.6%,滄州為99.7%,秦皇島為95.8%~99.7%,石家莊為95.2%,唐山為99.4%。其中核苷酸同源性最高的為滄州的CZ1和ffCZ,秦皇島的QHD2和ffQHD都是99.7%,核苷酸同源性最低為保定的BD1和ffBD1以及承德的CD1和ffCD1,各為95.5%。提示無論是同一地區(qū)的鼠和人之間,還是不同地區(qū)的鼠和人之
7、間,HV都是具有較高的同源性。
5.2人感染HV與鼠攜帶HV的G2片段核苷酸同源性比較及基因變異情況
從9份人血清和7份鼠肺中提取得標(biāo)本兩者之間G2片段核苷酸同源性高達92.7%~99.7%。其中CZ2和ffBD1之間的同源性為92.7%,CD2和ffCZ,BD3、BD1和ffSJZ,QHD和ffTS都分別為99.7%,其余的都在93.7%~99.3%之間。同一地區(qū)兩種標(biāo)本的分別為:保定為95.7%~98.7
8、%,承德為98.7%~99.3%,滄州為97.3%~98.3%,石家莊為94.7%,唐山為99.3%。其中核苷酸同源性最高的為承德的CD2和ffCD1以及唐山的TS和ffTS都是99.3%,核苷酸同源性最低石家莊的SJZ和ffSJZ為94.7%。
6.根據(jù)G1(217-573nt)和G2(2002-2301nt)片段用DNASTAR軟件包構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。G1片段構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示QHD、ffQHD、TS、ffTS株親緣關(guān)
9、系接近。ffBD1,SJZ株親緣關(guān)系接近, CZ1,ffCZ株親緣關(guān)系較近。G2片段構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹顯示ffSJZ,BD1,BD3株親緣關(guān)系接近, QHD2、TS、ffTS株親緣關(guān)系接近,SJZ,ffBD1株親緣關(guān)系接近,這與G1片斷的比較一致,說明兩地的同源性比較接近。其他序列同源性相對遠些。
7.基因分型及系統(tǒng)進化樹分析表明,河北省是典型的SEO型疫區(qū)。其基因亞型根據(jù)G1、G2片段分為S1、S3二個亞型,分型結(jié)果一致,
10、均以S3亞型為主,未發(fā)現(xiàn)新亞型。除承德一小家鼠所攜帶HV根據(jù)G1片段構(gòu)建進化樹分型為S4亞型, G1和G2片段的分型結(jié)果基本一致。
結(jié)論:
1.無論是同一區(qū)域,還是不同地區(qū),河北省人感染HV與鼠攜帶HV高度同源,褐家鼠攜帶的HV是HFRS病人感染的最主要來源。
2.河北省人感染HV以SEO型為主,共包括S1、S3兩個亞型,以S3亞型為主。疫源地宿主動物所攜帶的HV基因型以SEO型為主,基因亞型以
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