TLR4、MD2及CD14介導(dǎo)IL-6和TNF-α在早產(chǎn)分娩發(fā)動(dòng)中的作用研究.pdf

1、目的：研究早產(chǎn)自然分娩、足月自然分娩及足月?lián)衿谄蕦m產(chǎn)產(chǎn)婦外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4、MD2及CDl4 mRNA的表達(dá)水平，探討TLR4、MD2和CDl4表達(dá)與早產(chǎn)及亞臨床絨毛膜羊膜炎的關(guān)系。
　　 方法：選擇2008年8月-2009年5月，我院產(chǎn)科住院的早產(chǎn)自然分娩組(28周-36+6周)20例，足月妊娠自然分娩組(37周-41+6周)28例，足月?lián)衿谄蕦m產(chǎn)組(38+5周-41周)10例。收集每位受試對象抗凝的外周血2ml(自然分

2、娩組活躍早期采集標(biāo)本，剖宮產(chǎn)組術(shù)前采集標(biāo)本)，F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)( reverse transcription-polymerase chain reaction， RT-PCR）檢測外周血中TLR4、MD2、CD14mRNA的表達(dá)，并通過同一產(chǎn)婦胎盤HE染色，觀察TLR4、MD2、CD14的表達(dá)與亞臨床絨毛膜羊膜炎的關(guān)系。
　　 結(jié)果：
　　 1.三組產(chǎn)組外周血均可

3、檢測到TLR4、MD2、CD14的表達(dá)。自然分娩組產(chǎn)婦進(jìn)入活躍期后外周血TLR4、MD2、CD14mRNA高表達(dá)，早產(chǎn)自然分娩組TLR4mRNA(0.41±0.17)、MD2mRNA(0.39±0.20)表達(dá)水平明顯高于足月自然分娩組TLR4mRNA(0.18±0.85)、MD2mRNA(0.22±0.13)表達(dá)水平（p

4、p=0.42>O.05)。早產(chǎn)及足月自然分娩組TLR4、MD2、CD14mRNA表達(dá)均高于足月剖宮產(chǎn)組，早產(chǎn)自然分娩組與足月剖宮產(chǎn)組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05；而CD14表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p<0.05。
　　 2.20例早產(chǎn)自然分娩產(chǎn)婦有14例(70％)為亞絨毛膜羊膜炎患者；28例足月自然分娩產(chǎn)婦有9例(32.14％)為亞絨毛膜羊膜炎患者；

5、10例足月剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦有2例(20％)為亞絨毛膜羊膜炎患者。妊娠合并亞臨床絨毛膜羊膜炎組較妊娠無亞I臨床絨毛膜羊膜炎組，外周血中TLR4、MD2、CD14mRNA表達(dá)水平高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P　　 3.相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，孕婦外周血中TLR4、CD14、MD2mRNA表達(dá)水平，

6、兩兩之間均存在正相關(guān)關(guān)系。TLR4與MD2、TLR4與CD14、MD2與CD14表達(dá)的相關(guān)系數(shù)(r)分別為O.719、0.525、0.488，p　　 結(jié)論：
　　 1.早產(chǎn)自然分娩產(chǎn)婦，尤其合并亞臨床絨毛膜羊膜炎時(shí)外周血TLR4、MD2表達(dá)最高，提示可能與早產(chǎn)及感染有關(guān)。
　　 2.外周血中CDl4在自然分娩組表達(dá)均高于剖宮產(chǎn)組，但在自然分娩兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且在合并亞臨床絨毛膜羊膜炎時(shí)表達(dá)增加，

7、提示CDl4可能與分娩發(fā)動(dòng)及感染有關(guān)。
　　 目的：
　　 研究 TLR4、MD2及CDl4在胎盤組織不同部位的分布及表達(dá)。探討其在早產(chǎn)分娩中的意義。
　　 方法：采用免疫組化技術(shù)檢測三組產(chǎn)婦胎盤組織TLR4、MD2、CD14的表達(dá)及分布情況，并觀察TLR4、MD2、CD14表達(dá)與早產(chǎn)及亞臨床絨
　　 結(jié)果：
　　 1.免疫組化結(jié)果表現(xiàn)為：TLR4主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞、合體細(xì)胞小結(jié)、絨毛外滋

8、養(yǎng)細(xì)胞及羊膜細(xì)胞的胞漿和胞膜，胞核表達(dá)陰性；MD2主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞、合體細(xì)胞小結(jié)、絨毛間Hofbauer細(xì)胞、絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞及羊膜細(xì)胞的胞漿、胞膜及胞核，其中胞核表達(dá)強(qiáng)陽性；CD14分布較前兩者稍有差異，主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞及羊膜細(xì)胞的胞漿、胞膜，胞核表達(dá)陰性；還可表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，但絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)陰性。
　　 2.TLR4、：MD2、CD14在胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞及羊膜細(xì)胞表達(dá)，早產(chǎn)自然分娩組表達(dá)強(qiáng)于足月自然

9、分娩組，兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。兩組均表達(dá)強(qiáng)于足月剖宮產(chǎn)組。但TLR4蛋白表達(dá)在足月自然分娩組和剖宮產(chǎn)組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)，其余兩兩比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。
　　 3.TLRH、MD2及CD14在羊膜細(xì)胞分布具有極性。足月剖宮產(chǎn)組羊膜細(xì)胞中TLR4、MD2及CD14主要分布在羊膜細(xì)胞母體面，但早產(chǎn)自然分娩組和足月自然分娩組中TLR4、MD2及CD14在羊膜細(xì)胞的分布大都極性基本消失，表現(xiàn)為

10、胞漿表達(dá)陽性。
　　 4.絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TLR4、MD2，表達(dá)強(qiáng)弱在足月剖宮產(chǎn)組、足月自然分娩組和早產(chǎn)自然分娩組依次增強(qiáng)，組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.05)。CD14在絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)陰性。
　　 5.TLR4、MD2、CDl4在妊娠合并亞臨床絨毛膜羊膜炎組表達(dá)高于妊娠無亞臨床絨毛膜羊膜炎組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。妊娠合并亞臨床絨毛膜羊膜炎組TLR4、MD2及CD14在羊膜細(xì)胞的分布大都極性消失。

11、
　　 6.胎盤組織的TLR4、MD2、CD14的表達(dá)成正相關(guān)：胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞TLR4與MD2、TLR4與CD14、MD2與CD14的相關(guān)系數(shù)(r)分別為0.831、0.831、0.718，p

12、4表達(dá)陰性)。
　　 7.TLRH在外周血及胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)具有正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r=0.885，p<0.01；MD2及CD14在外周血及胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)亦具有正相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r分別為0.636，0.512，p<0.01。
　　 結(jié)論：
　　 1.胎盤中合體滋養(yǎng)細(xì)胞、羊膜細(xì)胞均可檢測到TLR4、MD2、CD14的表達(dá)。而絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞只有TLR4、MD2表達(dá)，CD14表達(dá)陰性。
　　 2.胎

13、盤中TLR4、MD2及CD14的表達(dá)及分布與早產(chǎn)和感染有關(guān)，且羊膜細(xì)胞的TLR4、MD2及CD14分布具有極性，分娩發(fā)動(dòng)和感染的情況下極性消失。
　　 3.外周血及胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞的TLR4、MD2、CD14表達(dá)具有正相關(guān)性，提示外周血的表達(dá)情況能反映胎盤部位的表達(dá)程度。
　　 目的:
　　 通過體外滋養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，利用中和性TLR4抗體阻斷TLR4技術(shù)，研究TLR4、MD2及CD14在LPS刺激反應(yīng)中對IL-6、

14、TNF-α表達(dá)水平的影響。
　　 方法：
　　 1.分離培養(yǎng)人足月胎盤的絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞，用不同濃度純化LPS刺激培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞不同時(shí)間，通過檢驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)胞TLR4mRNA(RT-PCR)和培養(yǎng)上清液中IL-6、TNF-α水平(ELISA法)，得到刺激最大炎癥反應(yīng)的最有效LPS濃度(10 ng/ml)和最佳時(shí)間(12 h)。
　　 2.將TLR4抗體(H-80)加入到胎盤培養(yǎng)液中，預(yù)處理后，再加入LPS(最有效濃度10

15、 ng/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)到反應(yīng)最佳時(shí)間(12 h)。利用RT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢驗(yàn)刺激后TLR4、MD2、CD14的mRNA、蛋白表達(dá)的差異，并用ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中促炎因子的變化情況以研究TLR4、MD2、CD14在LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)中的作用及生物學(xué)功能。
　　 結(jié)果：
　　 1.原代培養(yǎng)的絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)TLR4、MD2和CD14，LPS孵育刺激可使其表達(dá)明顯增強(qiáng)，伴隨細(xì)胞培養(yǎng)上清液

16、中促炎因子IL-6、TNF-α增加。
　　 2. LPS刺激后，TLR4mRNA和培養(yǎng)液上清液中促炎因子IL-6、TNF-α.僅隨作用時(shí)間延長表達(dá)增加，12 h達(dá)到高峰，繼續(xù)延長時(shí)間反而出現(xiàn)表達(dá)下降。
　　 3.1 ng/ml濃度的LPS即可引起TLR4mRNA和促炎因子表達(dá)顯著增加，此后隨著LPS濃度的增高，表達(dá)繼續(xù)增加，當(dāng)LPS濃度達(dá)到10ng/ml時(shí)，繼續(xù)增加LPS濃度，TLR4 mRNA和上清液中IL-6、TNF

17、-α表達(dá)未見增加，反而下降。
　　 4. TLR4、MD2、CD14mRNA和蛋白表達(dá)在LPS組、阻斷組和對照組變化一致，表現(xiàn)為LPS組細(xì)胞TLR4、MD2和CD14 mRNA和蛋白表達(dá)最高，與阻斷組、對照組相比較，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P