遺傳毒物苯并芘-非遺傳毒物誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)形成能力的研究.pdf

1、日前，與環(huán)境致癌物相關(guān)的腫瘤發(fā)病率呈上升趨勢，準(zhǔn)確地檢測環(huán)境中的致癌物是預(yù)防和治療癌癥的重要任務(wù)之一。致癌物包括遺傳毒物和非遺傳毒物。遺傳毒物通過損傷遺傳物質(zhì)DNA而起細(xì)胞毒作用。非遺傳毒物包括一些細(xì)胞毒素、免疫抑制劑等等，它們不通過與DNA作用而促進(jìn)癌癥的發(fā)生。迄今所知的大多數(shù)致癌物都是遺傳毒物，它們對(duì)DNA的損傷包括DNA單鏈斷裂(DNAsinglestrandbreaks，SSBs)、雙鏈斷裂(DNAdoublestrandbre

2、aks，DSBs)、DNA加合物形成、鏈內(nèi)/鏈間交聯(lián)及堿基置換等等，其中DSBs被認(rèn)為是最嚴(yán)重的損傷方式之一。因此，如何準(zhǔn)確對(duì)DSBs的檢測有助于癌癥的預(yù)防和治療。 近年來研究發(fā)現(xiàn)，DSBs出現(xiàn)后，組蛋白家族成員H2AXC-端139位絲氨酸殘基(Ser)可被磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase，PI3K)樣家族成員磷酸化形成γH2AX(gamma-H2AX)。γH2AX可以募集其它DNA修

3、復(fù)蛋白到損傷位點(diǎn)，形成焦點(diǎn)(foci)結(jié)構(gòu)，共同完成DNA修復(fù)過程。在電離輻射(IR)后，在損傷位點(diǎn)快速形成γH2AX焦點(diǎn)，并且焦點(diǎn)的數(shù)量與IR造成的DSBs的數(shù)量存在一一對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明γH2AX焦點(diǎn)的形成可用于檢測IR誘導(dǎo)的DSBs。另外發(fā)現(xiàn)，其它間接導(dǎo)致DSBs的遺傳毒物如順鉑、喜樹堿也誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)的形成。因此，直接或者間接導(dǎo)致的DSBs的產(chǎn)生都能誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)的形成。γH2AX焦點(diǎn)與DSBs之間的密切關(guān)系表明γH2AX極

4、有可能成為檢測細(xì)胞DNA損傷特別是DSBs的一個(gè)新的特異性指標(biāo)。 苯并(a)芘(B(a)P)是典型的強(qiáng)致癌性的多環(huán)芳烴類化合物，是一種間接遺傳毒物，進(jìn)入體內(nèi)需經(jīng)過細(xì)胞色素P450家族代謝活化才呈現(xiàn)強(qiáng)致癌作用。其終代謝產(chǎn)物二氫二醇環(huán)氧苯并芘(BPDE)可以與DNA共價(jià)結(jié)合，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長分化功能失調(diào)而癌變。 咪唑硫嘌啉(Aza)、環(huán)孢素霉A(CsA)是臨床上常用的免疫抑制劑，主要用于移植后的排斥反應(yīng)。它們可以促進(jìn)細(xì)胞的壞

5、死，對(duì)細(xì)胞的損傷不通過遺傳物質(zhì)DNA，是非遺傳毒物質(zhì)。 由于γH2AX極有可能成為檢測細(xì)胞DNA損傷特別是DSBs的一個(gè)新的特異性指標(biāo)，我們選擇了一系列的物理/化學(xué)因素作用于人羊膜上皮FL細(xì)胞，研究細(xì)胞在不同處理因素作用下γH2AX焦點(diǎn)的形成情況。本研究基于這個(gè)基礎(chǔ)上，研究間接遺傳毒物B(a)P，非遺傳毒物Aza/CsA損傷細(xì)胞后γH2AX焦點(diǎn)形成情況。 我們用MTT比色法觀察了各種濃度的B(a)P(0.01，0.1，1

6、，10，20，50，100μM)及Aza(20μg/ml)、CsA(20μg/m)對(duì)FL細(xì)胞的毒性作用，發(fā)現(xiàn)各濃度的B(a)P對(duì)FL細(xì)胞生存率沒有明顯影響，20μg/ml的Aza和CsA則具有明顯的細(xì)胞毒作用。 通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在各濃度的B(a)P(0.1，1，10，50μM)處理細(xì)胞10min、2h，沒有明顯誘導(dǎo)γH2AX焦點(diǎn)形成。8h、24h時(shí)，則有明顯誘導(dǎo)了γH2AX焦點(diǎn)的形成，并且有明顯的時(shí)間、劑量依賴效應(yīng)，最高濃

7、度50μM作用后，焦點(diǎn)形成最多、最強(qiáng)。24h時(shí)甚至也比8h時(shí)候有更多的細(xì)胞中含有γH2AX焦點(diǎn)。我們還發(fā)現(xiàn)，在50μMB(a)P作用后，有大量的微核(micronuclei)形成。而20μg/mlAza/CsA作用FL細(xì)胞后檢測γH2AX焦點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，γH2AX焦點(diǎn)數(shù)量沒有顯著變化。 通過中性彗星實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)B(a)P能誘導(dǎo)細(xì)胞DSBs，而Aza/CsA不能誘導(dǎo)DSBs。 結(jié)論：1.間接遺傳毒物B(a)P能誘導(dǎo)γH2