類姜黃素及其單體抑制Aβ-,42-生成作用的強(qiáng)弱比較及機(jī)制探討.pdf

1、阿爾茨海黙病(AD)是最常見的癡呆類型，目前廣泛認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制是β淀粉樣蛋白(Aβ)級(jí)聯(lián)假說，Aβ的聚集、纖維化、寡聚體形成被認(rèn)為是AD病理的起始因素。Aβ由β-淀粉樣蛋白前體(APP)經(jīng)β-分泌酶(BACE1)和γ-分泌酶酶切后生成的。常見的Aβ片段是Aβ40和Aβ42，Aβ42雖然所占的比例僅10％左右，但Aβ42比Aβ40更易聚集、纖維化，形成粥樣斑塊的核心，毒性作用更強(qiáng)。因此如何抑制Aβ42的生成或促進(jìn)Aβ42的清除是目前研究的

2、熱點(diǎn)，期望以此尋找從源頭上阻斷疾病進(jìn)展的藥物是治療AD的希望。體外實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已證實(shí)姜黃素可抑制Aβ的產(chǎn)生，然而目前在AD相關(guān)的研究中應(yīng)用的姜黃素多是類姜黃素化合物，為明確其單體成分的作用，我們課題組分離提純了類姜黃素(包括姜黃素Cur，去甲氧基姜黃素DMC，雙去甲氧基姜黃素BDMC)的三種單體成分，并且證實(shí)在swAPP HEK293(轉(zhuǎn)染APP基因瑞典突變型)細(xì)胞中，類姜黃素及三種單體成分劑量依賴性的抑制Aβ的生成。鑒于Aβ42在A

3、D病理中的核心作用，本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)比較了類姜黃素及單體成分對(duì)Aβ42的不同影響。研究表明姜黃素可以逆轉(zhuǎn)金屬離子、維甲酸及Aβ42誘導(dǎo)的APP和BACE1表達(dá)的上調(diào)，然而類姜黃素及其單體對(duì)APP及BACE1的直接影響尚未見報(bào)道，目前姜黃素抑制Aβ產(chǎn)生的機(jī)制尚不是很清楚。由此，提出了本實(shí)驗(yàn)：
　　 目的：比較類姜黃素及其單體成分抑制Aβ42生成作用的強(qiáng)弱，期望找出最有效的單體成分；通過檢測(cè)藥物在mRNA和蛋白水平對(duì)APP及BACE1的直

4、接影響，探討其抑制Aβ生成的可能機(jī)制，為姜黃素應(yīng)用于AD患者提供理論依據(jù)。
　　 方法：結(jié)合本課題組前期工作，選取的藥物終濃度為5μM，以5μM類姜黃素及單體成分或0.005％二甲基亞砜(對(duì)照組)作用于swAPP HEK293細(xì)胞24h后：①M(fèi)TT法檢測(cè)細(xì)胞活性；②ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中分泌型Aβ42濃度；③RT-PCR方法檢測(cè)APP及BACE1 mRNA的水平；④Westem Blot檢測(cè)APP及BACE1蛋白水平的

5、表達(dá);⑤運(yùn)用Real-Time PCR初步研究了Cur對(duì)microRNAs中的miR17-5p和miR-106b的影響。
　　 結(jié)果：⑴5μM濃度的類姜黃素及單體對(duì)細(xì)胞活性無明顯影響，表明對(duì)細(xì)胞無毒性作用；⑵類姜黃素及其三種單體成分都可明顯抑制Aβ42的生成，作用強(qiáng)弱依次為Cur＞DMC＞類姜黃素＞BDMC；⑶類姜黃素及其三種單體成分對(duì)APP mRNA無影響；在蛋白水平僅Cur能抑制APP的表達(dá)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；

6、⑷DMC及BDMC能降低BACE1 mRNA的表達(dá)，與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；類姜黃素及Cur對(duì)BACE1 mRNA無影響。僅BDMC能抑制BACE1蛋白的表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；類姜黃素、Cur及DMC對(duì)BACE1蛋白的表達(dá)無明顯影響。⑸Cur對(duì)miR17-5p和miR-106b無明顯影響。
　　 結(jié)論：①在swAPPHEK293細(xì)胞中，類姜黃素及單體抑制Aβ42生成作用的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篊ur＞DMC＞類姜黃素＞BDMC；