應(yīng)用非線性光學(xué)成像技術(shù)診斷移植腎間質(zhì)纖維化的初步研究.pdf

1、研究背景:腎移植作為終末期腎病的最佳替代治療選擇在全世界廣泛的開展，我國(guó)是僅次于美國(guó)的第二大移植大國(guó)。至2002年底，全世界納入統(tǒng)計(jì)的腎移植數(shù)量超過55萬例次，親屬腎移植存活時(shí)間最長(zhǎng)者達(dá)39年，尸體腎移植達(dá)30年。隨著配型技術(shù)的提高和新型免疫抑制劑不斷應(yīng)用于臨床，腎移植的近期效果明顯提高，移植腎半數(shù)生存時(shí)間由原來的6.7年提高到10.9年。但據(jù)統(tǒng)計(jì)過去10年移植腎長(zhǎng)期存活卻沒有明顯改善。而幾乎所有移植腎都存在慢性間質(zhì)纖維化的過程，35～

2、40％的移植腎失功是由于間質(zhì)纖維化直接導(dǎo)致。因此研究如何診斷和防治移植腎間質(zhì)纖維化，延長(zhǎng)移植腎的長(zhǎng)期生存壽命，成為亟待解決的問題。
　　 移植腎間質(zhì)纖維化(RAIF)是損傷因素和修復(fù)因素不斷作用的結(jié)果，其實(shí)質(zhì)是膠原纖維在腎間質(zhì)堆積和改造的過程。目前實(shí)驗(yàn)研究表明眾多細(xì)胞因子與纖維化關(guān)系密切。TGF-β在腎間質(zhì)纖維化過程中起著關(guān)鍵的作用;AT-Ⅱ能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增生，抑制其凋亡，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化發(fā)生；尚;包括ET-1、IL-1、

3、PDGF、TNF-α等因子參與腎臟纖維化的過程。這些血清學(xué)指標(biāo)雖可以間接反應(yīng)腎間質(zhì)纖維化的程度，但無特異性。而目前“金標(biāo)準(zhǔn)”腎組織活檢是基于膠原纖維特殊性染色和病理醫(yī)生的人為評(píng)估，客觀性和重復(fù)性差，對(duì)腎間質(zhì)纖維化的評(píng)估比較粗略，無法進(jìn)行精確的定量分析。
　　 非線性光學(xué)成像技術(shù)為研究組織內(nèi)膠原纖維提供了一種新的方法。在非線性光學(xué)成像技術(shù)中，二次諧波(SHG)最適合對(duì)組織非中心對(duì)稱性分子進(jìn)行成像，SHG信號(hào)強(qiáng)弱與生物組織中的膠原含

4、量密切相關(guān)，能特異性顯示纖維性膠原沉積情況及三維形態(tài)。雙光子激發(fā)熒光(TPEF)是另外一種光學(xué)現(xiàn)象，標(biāo)本無需熒光染色，直接獲取組織內(nèi)的天然熒光信號(hào)來顯示組織細(xì)胞等結(jié)構(gòu)。兩種成像裝置兼容，復(fù)合成像可以互為印證和補(bǔ)充，直接展現(xiàn)組織形態(tài)。目前已用于包括角膜、鼠尾肌腱、人的皮膚及疤痕組織、小鼠的腎臟、大鼠的肝臟、人的肝臟等膠原纖維的成像，以及用于鼻咽癌、腎癌、肝癌等腫瘤判斷良惡性、是否復(fù)發(fā)等多個(gè)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。與傳統(tǒng)病理染色技術(shù)相比，非線性光學(xué)成

5、像技術(shù)有以下優(yōu)勢(shì):①SHG能夠區(qū)分纖維膠原和非纖維膠原蛋白，對(duì)病理性膠原纖維堆積具有特異性，可以定量測(cè)定。②組織標(biāo)本無需染色，可以排除染料成分、染色步驟或褪色等原因產(chǎn)生的染色差異;可以避免受到使用熒光劑所帶來的濃度和光漂白效應(yīng)的影響。③可以顯示纖維膠原三維結(jié)構(gòu)。④TPEF可以補(bǔ)充結(jié)構(gòu)和細(xì)胞成分信息。
　　 目的:
　　 1.收集病理資料，掌握我科移植腎活檢病理的相關(guān)數(shù)據(jù)資料，為下一步實(shí)驗(yàn)選擇病例及準(zhǔn)備標(biāo)本。
　　

6、 2.了解非線性光學(xué)成像技術(shù)對(duì)移植腎間質(zhì)纖維化的成像效果，并與傳統(tǒng)病理方法對(duì)比來驗(yàn)證其優(yōu)勢(shì)。
　　 3.探索使用非線性光學(xué)成像技術(shù)進(jìn)行移植腎間質(zhì)纖維化的定量方法。
　　 方法:
　　 1.病理資料的收集
　　 a)研究對(duì)象研究對(duì)象為2005-2011年之間在我科行移植腎活檢術(shù)并且可以查找到完整病理資料及相關(guān)臨床資料的患者，共有663例次。包括尸體腎移植，親屬活體腎移植及臨床心臟死亡捐獻(xiàn)的腎移植受者的腎活檢

7、資料。
　　 b)研究?jī)?nèi)容資料收集的內(nèi)容包括:患者的基本信息;移植腎穿刺活檢的指征分布;病理結(jié)果的分布;特殊病理結(jié)果的分析及相關(guān)臨床資料等。
　　 c)研究方法所有收集的病理標(biāo)本均在我院病理科獲得，病理切片常規(guī)進(jìn)行HE、Masson、PAS染色。所有病理報(bào)告都是由病理科醫(yī)師依照Banff05和Banff07的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理診斷及分級(jí)。
　　 2.非線性光學(xué)成像技術(shù)在移植腎間質(zhì)纖維化診斷中的應(yīng)用
　　 a)病

8、例收集從上面收集的663例次的腎活檢病理資料中選出40例患者的40次病理活檢資料，輕度纖維化22例，中重度纖維化18例，收集其病理資料及相關(guān)臨床資料。收集了2只正常wistar大鼠右側(cè)腎臟組織。
　　 b)標(biāo)本準(zhǔn)備在我院病理科獲取40例患者移植腎活檢組織的石蠟標(biāo)本，并將2只大鼠右腎組織標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋。病理切片厚度為4μm，連續(xù)切2張病理切片，分別標(biāo)記為1、2，將標(biāo)本脫蠟晾干，第1張行HE染色。第2張切片脫蠟晾干后無需做任何處理

9、，直接使用非線性光學(xué)設(shè)備獲取SHG/TPEF圖片，再將第2張切片行Masson染色。以比較同一切片相同部位2種方法對(duì)間質(zhì)纖維化的成像情況，減少誤差。
　　 c)實(shí)驗(yàn)方法所有的傳統(tǒng)病理染色方法均在我院病理科完成，均按照傳統(tǒng)的HE、Masson染色方法進(jìn)行。非線性光學(xué)成像技術(shù)的方法包括:登陸Genesis操作軟件系統(tǒng)→按界面指示載入病理切片標(biāo)本→設(shè)置掃描參數(shù)→選定掃描區(qū)域→開始掃描圖片→將所掃描的圖片按照掃描的先后秩序進(jìn)行拼合，圖片

10、存為“tif”格式。其中人移植腎穿刺標(biāo)本沿標(biāo)本長(zhǎng)軸將整個(gè)標(biāo)本全部掃描完成。大鼠腎臟標(biāo)本按照皮質(zhì)5個(gè)區(qū)域、髓質(zhì)3個(gè)區(qū)域、集合系統(tǒng)1個(gè)區(qū)域進(jìn)行掃描，每個(gè)區(qū)域大小按照5×5張（每張圖片分辨率為512×512 pixel，放大倍數(shù)為20倍）。
　　 3.探索使用SHG/TPEF圖像進(jìn)行移植腎間質(zhì)纖維化的定量分析方法
　　 a)研究對(duì)象:實(shí)驗(yàn)中同一張切片所取得的SHG/TPEF圖像和Masson圖像，共采集了20張標(biāo)本圖像。

11、>　　 b)研究?jī)?nèi)容:使用Image-Pro-Plus6.0(IPP)圖像處理軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)中取得的SHG/TPEF圖像及Masson圖像進(jìn)行分析，定量分析移植腎間質(zhì)纖維化。
　　 c)研究方法:使用IPP軟件的圖像計(jì)算功能對(duì)SHG/TPEF圖像及Masson圖像中纖維化面積占整張圖片的面積百分比進(jìn)行計(jì)算。主要步驟包括:進(jìn)入軟件界面→打開分析圖片→設(shè)置計(jì)算參數(shù)→選定纖維化范圍→計(jì)算并輸出結(jié)果。
　　 4.統(tǒng)計(jì)方法: 計(jì)量資

12、料的描述以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）來表示，兩組患者的基本資料采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)SHG/TPEF圖片定量法和Masson圖片定量法得出的分級(jí)結(jié)果進(jìn)行平行效度檢驗(yàn)，得出的kappa值＞0.75表示一致性好，0.40≤kappa值≤0.75表示一致性較好，kappa值＜0.4表示一致性差。
　　 結(jié)果:
　　 1.該科2005-2011年期間移植腎活檢病理資

13、料及相關(guān)臨床資料分析
　　 移植腎活檢最主要的指征是不明原因的血肌酐升高，占全部指征的74.36％，第二位的活檢指征是蛋白尿/血尿。移植腎病理結(jié)果顯示排斥反應(yīng)占59.28％，其中急性排斥反應(yīng)204例次(30.77％)，慢性排斥反應(yīng)189例次(28.51％)。分析近幾年數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)我科急性排斥的發(fā)生率呈下降趨勢(shì)。病理結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)新發(fā)/復(fù)發(fā)性腎病9例，乙肝相關(guān)性腎病9例。
　　 整理了15例部分程序性腎活檢病例，發(fā)現(xiàn)其中5例出現(xiàn)

14、早期的腎臟病變，其中1例診斷為IgA腎病，另有2例發(fā)現(xiàn)了輕度的腎小管萎縮腎間質(zhì)纖維化，2例診斷為隱匿性排斥反應(yīng)。
　　 2.非線性光學(xué)成像技術(shù)在移植腎間質(zhì)纖維化診斷中的應(yīng)用
　　 獲得的SHG/TPEF圖像由SHG信號(hào)和TPEF信號(hào)相互疊加而成。其中SHG圖像呈綠色信號(hào)，代表膠原纖維組織;TPEF圖像呈紅色信號(hào)，代表腎組織圖像。大鼠腎臟和人移植腎活檢組織標(biāo)本的SHG/TPEF圖像都可以清晰的分辨出腎小球、腎小管、腎血管等

15、腎組織的鏡下結(jié)構(gòu)，可以觀察到腎間質(zhì)和腎小球、腎小管及腎血管周圍分布的呈綠色信號(hào)的膠原組織沉積。SHG/TPEF圖像既能夠清晰顯示腎臟膠原纖維及腎組織結(jié)構(gòu)，又可以呈現(xiàn)纖維膠原在腎臟中沉積的部位。
　　 與傳統(tǒng)的Masson染比較，SHG/TPEF圖像也可以清晰的顯示腎組織的基本結(jié)構(gòu)。對(duì)于輕度移植腎間質(zhì)纖維化的標(biāo)本，SHG/TPEF圖像可以清晰的顯示在腎小球周圍、腎小血管周圍、腎小管周圍及腎間質(zhì)內(nèi)少量散在的呈綠色信號(hào)的膠原纖維沉積，

16、而Masson染色基本正常，未發(fā)現(xiàn)輕度的纖維化表現(xiàn)。對(duì)于中重度移植腎間質(zhì)纖維化的標(biāo)本，SHG/TPEF圖像顯示與Masson染色基本相同，但可以更直觀更容易的觀察到呈綠色信號(hào)的纖維膠原分布的范圍及沉積的部位。
　　 3.移植腎間質(zhì)纖維化的定量方法
　　 由于SHG/TPEF圖像只有紅色和綠色兩種顏色組成，使用IPP軟件可以很輕松的對(duì)SHG/TPEF圖像上呈綠色的纖維膠原面積百分比進(jìn)行定量計(jì)算。根據(jù)計(jì)算結(jié)果得出的Banff

17、分級(jí)與臨床病理報(bào)告分級(jí)基本吻合。同時(shí)將SHG/TPEF圖像定量法與Masson圖像定量法得出的結(jié)果進(jìn)行平行效度檢驗(yàn)，得出kappa值為0.835，表示兩種方法的結(jié)果一致性好。
　　 結(jié)論：
　　 1.移植腎活檢是確診移植腎病變的重要方法，程序性活檢還可以及時(shí)發(fā)現(xiàn)早期隱匿性的移植腎病變。移植腎活檢在協(xié)助臨床明確疾病診斷，指導(dǎo)臨床治療方面起著至關(guān)重要的作用，對(duì)提高移植腎遠(yuǎn)期存活時(shí)間意義重大。
　　 2.非線性光學(xué)成像