利用精子載體方法研制人組織型纖溶酶原激活劑突變體轉(zhuǎn)基因羊乳腺生物反應(yīng)器.pdf

1、利用轉(zhuǎn)基因動物乳腺生產(chǎn)醫(yī)藥用蛋白，具有產(chǎn)量高和生產(chǎn)成本低等明顯優(yōu)勢，前景普遍看好，但動物乳腺生物反應(yīng)器的獲得有賴于可靠的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)制備技術(shù)作保證。 精子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移(Sperm-mediatedgenetransfer,SMGT)被認為是目前操作最簡單的轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)技術(shù)，但該方法的重復(fù)性差、實驗結(jié)果不穩(wěn)定，因此也是一種不成熟的技術(shù)體系?；赟MGT的不成熟性，本實驗將對SMGT的幾個關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行研究，以期建立穩(wěn)定、高效的S

2、MGT技術(shù)平臺，同時利用該技術(shù)平臺研制人組織型纖溶酶原激活劑突變體(variantformofhumantissue-typeplasminogenactivator,mt-PA)轉(zhuǎn)基因羊乳腺生物反應(yīng)器，為安全高效的溶栓藥物mt-PA規(guī)模化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。實驗結(jié)果如下： 1)山羊精子可自發(fā)性結(jié)合外源DNA，精子對外源DNA的結(jié)合和內(nèi)化能力在不同個體間差異顯著(P＜0.01)。對于同一供體的精子而言，阻止DNA結(jié)合的最主要因素是精漿

3、，離心洗滌后，結(jié)合率和內(nèi)化率可提高數(shù)倍。 2)死精子同樣能結(jié)合外源DNA，但不能將其內(nèi)化，反復(fù)凍融導(dǎo)致質(zhì)膜破裂的死精子具有更高的結(jié)合率，而且與動物個體無關(guān)。 3)精漿既可能與DNA形成復(fù)合物，改變DNA的物理性質(zhì)，又可能對游離DNA產(chǎn)生降解，精漿的作用效應(yīng)呈濃度和時間依賴性；EGTA對精漿的復(fù)合效應(yīng)和降解效應(yīng)有明顯的抑制作用。 4)內(nèi)化進入精細胞中的外源DNA大部分將被降解，EGTA/ATA能有效保護內(nèi)化DNA的

4、完整性而不影響精子的其他生物學(xué)特性。 5)轉(zhuǎn)染精子用于體外受精，報告基因GFP可被精子介導(dǎo)進入卵母細胞，并在早期胚胎中表達，胚胎陽性率和GFP表達率與精子結(jié)合外源DNA的能力相關(guān)。 6)精子與山羊乳腺特異性表達pBGC-mtPA線性化質(zhì)粒DNA共同孵育后，人工受精得到129只羔羊，其中24只PCR陽性(陽性率18.6％)，15只Southernblot陽性(陽性率11.6％，15/129)。但轉(zhuǎn)染精子受精能力下降，畸形羔