小鼠腎近端小管與出球微動脈的三維重建.pdf

1、目的：
　　 腎單位是腎結(jié)構(gòu)和功能的基本單位，由腎小體和腎小管組成。近端小管在對腎小球超濾液中蛋白質(zhì)、Na+、HCO3-、Cl-、K+、Ca2+、PO43-，水與有機溶質(zhì)（如葡萄糖與氨基酸）的重吸收中發(fā)揮著重要作用，大約二分之一的超濾液在近端小管處重吸收。來自皮質(zhì)不同水平的腎單位近端小管有其各自的走行特點并行使相應(yīng)的功能。應(yīng)用傳統(tǒng)方法得到的關(guān)于小鼠近端小管的走行及毗鄰關(guān)系等信息僅僅局限于曲部與直部的鑒別。很多關(guān)于小鼠近端小管的功

2、能研究常常借用大鼠近端小管的節(jié)段性加以討論。
　　 出球微動脈起自腎小球毛細血管網(wǎng)，在腎皮質(zhì)終止于腎小管周圍毛細血管網(wǎng)，在髓質(zhì)終止于直小血管。出球微動脈管徑較小，阻力較大，血液流經(jīng)該段時，血壓降落較大，故腎小管周圍毛細血管的血壓較低，這一點對腎小管的重吸收十分重要。作為功能性研究的基礎(chǔ)，其形態(tài)學(xué)特點至關(guān)重要。但由于小鼠的個體較小，出球微動脈管徑較細，應(yīng)用傳統(tǒng)方法很難建立其確切的空間走行。
　　 本研究利用計算機輔助三維重

3、建技術(shù)，以小鼠腎組織連續(xù)切片形成的系列配準(zhǔn)顯微圖像為基礎(chǔ)，重建腎近端小管與出球微動脈的確切空間走行，為腎臟相應(yīng)功能的研究與相關(guān)腎臟疾病的治療提供了重要的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。
　　 實驗方法：
　　 1、樹脂包埋連續(xù)切片的制備
　　 腎組織取自三只體重為25g的C57/BL/6小鼠。腹主動脈灌流固定（1％戊二醛和4％羥乙基淀粉，0.06mol/L的二甲胂酸鈉緩沖液配制，PH 7.4）。垂直于腎長軸取組織塊，鋨酸后固定2h，

4、梯度酒精丙酮脫水，樹脂812包埋。采用超薄切片機及鉆石刀進行半薄切片，從腎被膜到腎外髓外帶，共得到2.5 μm厚的連續(xù)切片1200張，通過甲苯胺藍染色顯示組織微細結(jié)構(gòu)。
　　 2、顯微圖像獲取與配準(zhǔn)
　　 應(yīng)用“計算機-顯微鏡-數(shù)碼相機”圖像采集系統(tǒng)（Olympus AX 70顯微鏡；Olympus DP 50相機），每隔一張切片進行拍照。圖像大小為2596×1889像素，每個像素相當(dāng)于1.16 μm×1.16 μm。圖

5、像配準(zhǔn)過程在計算機Windows平臺上操作。其原理是通過比較相鄰兩幅圖像中生理對應(yīng)點的像素灰度值的相似性來確定每個圖像的平移及旋轉(zhuǎn)，使其達到生理空間的一致。首先得出相鄰兩幅圖的相對變換值（平移距離和旋轉(zhuǎn)角度），再通過計算相對變換值的相加函數(shù)得出系列圖像中每個圖像的絕對變換值，從而實現(xiàn)圖像配準(zhǔn)。
　　 3、數(shù)字追蹤與三維分析
　　 腎近端小管和出球微動脈路徑的追蹤是通過C語言設(shè)計的程序在計算機Linux平臺上實現(xiàn)的。近端小

6、管的追蹤始于腎小球尿極，終止于近端小管直部和髓袢降支細段上皮移行處。出球微動脈的追蹤始于腎小球血管極，終止于出球微動脈與腎小管周圍毛細血管網(wǎng)或直小血管連接處。本實驗追蹤了來自3只小鼠58個腎單位的近端小管和出球微動脈。追蹤過程自動生成一個數(shù)據(jù)文件，記錄追蹤小管與血管走行的空間坐標(biāo)，基于此坐標(biāo)集，近端小管與出球微動脈的毗鄰關(guān)系分析以及長度測量等得以實現(xiàn)。長度的測量運用歐幾里德算法，即累加沿近端小管或出球微動脈走行的每兩個連續(xù)點的距離，得出

7、沿近端小管或出球微動脈走行任意兩點之間的距離。
　　 x∑i-2√（xi-xi-1）2+（yi-yi-1）2+（zi-zi-1）2
　　 實驗結(jié)果：
　　 1、近端小管的空間走行
　　 在皮質(zhì)迷路中，近端小管起始段離開腎小球后，都先向被膜方向走行約100～14001ma后返折，在各自腎小球周圍盤曲并占據(jù)相對獨立的區(qū)域，而且很少和來自其他腎單位的近端小管曲部所在區(qū)域重合。來自淺表皮質(zhì)腎單位與中間皮質(zhì)腎單位的

8、近端小管曲部盤曲緊密，所占空間比近髓腎單位近端小管曲部小。在髓放線中，近端小管直部的走行具有明顯的層次：來自淺表皮質(zhì)腎單位的近端小管直部走行于中央，來自中間皮質(zhì)腎單位和近髓腎單位的近端小管直部則依次走行在其外圍，來自皮質(zhì)最深層的腎單位的近端小管幾乎沒有直部。所有近端小管都止于腎外髓外帶與內(nèi)帶的交界處，并移行為髓袢降支細段。
　　 2、出球微動脈的空間走行
　　 在來自淺表皮質(zhì)腎單位的出球微動脈中，87.5％離開腎小球血管

9、極后向被膜方向上行，然后移行為腎小管周圍毛細血管網(wǎng)。8.3％的出球微動脈離開腎小球血管極后向皮質(zhì)深層下行，然后移行為腎小管周圍毛細血管網(wǎng)。4.2％的出球微動脈離開腎小球血管極后立即移行為腎小管周圍毛細血管網(wǎng)。
　　 在來自中間皮質(zhì)腎單位的出球微動脈中，48.0％離開腎小球血管極后向皮質(zhì)深層下行，然后移行為腎小管周圍毛細血管網(wǎng)。32.0％的出球微動脈離開腎小球血管極后向被膜方向上行，然后移行為腎小管周圍毛細血管網(wǎng)。8.0％的出球微

10、動脈離開腎小球血管極后立即移行為腎小管周圍毛細血管網(wǎng)。然而，與來自淺表皮質(zhì)腎單位的出球微動脈不同的是，來自中間皮質(zhì)腎單位的出球微動脈中有12％離開腎小球血管極后先向皮質(zhì)深層下行一段距離，然后返折，接著再向被膜方向上行，直至移行為腎小管周圍毛細血管網(wǎng)。
　　 在來自近髓腎單位的出球微動脈中，66.7％離開腎小球血管極后向內(nèi)髓方向下行直至移行為腎小管周圍毛細血管網(wǎng)或直小血管。22.2％的出球微動脈離開腎小球血管極后立即移行為腎小管周

11、圍毛細血管網(wǎng)或直小血管。11.1％的出球微動脈離開腎小球血管極后先向內(nèi)髓方向下行一段距離，然后返折，接著再向被膜方向上行，直至移行為腎小管周圍毛細血管網(wǎng)或直小血管。
　　 除了少數(shù)出球微動脈離開腎小球血管極后立即移行為腎小管周圍毛細血管網(wǎng)，無法計算其長度。來自淺表皮質(zhì)腎單位與中間皮質(zhì)腎單位的出球微動脈的長度都在10～260μm范圍內(nèi)。而來自近髓腎單位的出球微動脈長度則在120～250μm范圍內(nèi)。
　　 3、近端小管與出球