小鼠腎連接小管數(shù)字三維重建及其細(xì)胞成分分析.pdf

1、目的：
　　 腎連接小管(Connecting tubule，CNT)是腎單位和集合管之間的過(guò)渡小管。在走行上，來(lái)自淺表皮質(zhì)腎單位和近髓腎單位的連接小管與集合管的相接方式不同，走行的毗鄰關(guān)系不同，并有種屬差異。由于連接小管的上皮細(xì)胞成分由遠(yuǎn)曲小管和集合管上皮細(xì)胞成分以及它自身細(xì)胞成分組成，因此，連接小管兼具遠(yuǎn)曲小管和集合管的功能，同時(shí)又有連接小管細(xì)胞自身的重要功能，即微調(diào)Na、K、H等離子和水的重吸收。此外，免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)顯示

2、，連接小管細(xì)胞上存在激肽釋放酶，具有擴(kuò)張血管的功能。此段小管雖然對(duì)鈉、氫和水的轉(zhuǎn)運(yùn)不是最主要的節(jié)段，但是，對(duì)腎的重吸收的整體調(diào)節(jié)包括腎血循環(huán)和激素調(diào)節(jié)起重要的反饋?zhàn)饔?。本研究借助?jì)算機(jī)強(qiáng)大的圖像處理和編程功能，對(duì)小鼠腎連接小管走行進(jìn)行追蹤，并在三維可視化的同時(shí)測(cè)量其長(zhǎng)度。在此基礎(chǔ)上，采用免疫組織化學(xué)方法，通過(guò)三維追蹤的數(shù)據(jù)，對(duì)兩種髓襻腎單位的連接小管的上皮轉(zhuǎn)運(yùn)體的分布進(jìn)行研究，從而分析連接小管復(fù)雜細(xì)胞成分的分布。
　　 實(shí)驗(yàn)方法

3、：
　　 1、樹(shù)脂連續(xù)切片的標(biāo)本制備
　　 腎組織取自3只體重為25g的C57/BL/6J小鼠。腹主動(dòng)脈灌流固定（1％戊二醛），同等緩沖液續(xù)固定過(guò)夜。垂直于腎長(zhǎng)軸取組織塊，鋨酸后固定，梯度酒精丙酮脫水置換，樹(shù)脂812包埋。采用超薄切片機(jī)進(jìn)行半薄切片，從腎被膜到腎乳頭，共得到2.5μm厚的連續(xù)切片2000張左右，甲苯胺藍(lán)染色。
　　 2、顯微圖像獲取與配準(zhǔn)
　　 應(yīng)用“計(jì)算機(jī)-顯微鏡-數(shù)碼相機(jī)”圖像采集系統(tǒng)

4、，每隔一張切片進(jìn)行拍照。圖像大小為2596×1889像素，每個(gè)像素相當(dāng)于1.16μm×1.16μm。圖像配準(zhǔn)引進(jìn)丹麥奧胡斯大學(xué)細(xì)胞生物系A(chǔ)ndreason教授自主研發(fā)的配準(zhǔn)算法，在計(jì)算機(jī)Windows平臺(tái)上進(jìn)行操作。簡(jiǎn)言之，通過(guò)比較相鄰兩幅圖像中生理對(duì)應(yīng)點(diǎn)的像素灰度值的相似性，得出相鄰兩幅圖的相對(duì)變換值（平移距離和旋轉(zhuǎn)角度），計(jì)算相對(duì)變換值的相加函數(shù)，得出系列圖像中每個(gè)圖像的絕對(duì)變換值，從而實(shí)現(xiàn)圖像配準(zhǔn)。
　　 3、數(shù)字追蹤及三

5、維分析
　　 腎連接小管的追蹤和長(zhǎng)度測(cè)量是在計(jì)算機(jī)Linux平臺(tái)上，通過(guò)C語(yǔ)言設(shè)計(jì)的系列程序?qū)崿F(xiàn)的。腎小管走行的追蹤始于腎小球尿極，終止于集合管在內(nèi)髓的遠(yuǎn)側(cè)端。本研究追蹤了來(lái)自3個(gè)小鼠腎的38個(gè)腎單位，以及與之相連的6個(gè)集合管。通過(guò)對(duì)腎單位的全程追蹤，確立連接小管來(lái)自于腎單位的種類。連接小管起始部的確立標(biāo)志是腎單位遠(yuǎn)曲小管上皮結(jié)構(gòu)特征的消失。
　　 追蹤過(guò)程自動(dòng)生成一個(gè)數(shù)據(jù)文件，記錄小管走行的空間坐標(biāo)?；诖俗鴺?biāo)集，連接

6、小管走行的毗鄰關(guān)系分析及長(zhǎng)度測(cè)量得以實(shí)現(xiàn)。
　　 4、連接小管膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的免疫組織化學(xué)染色
　　 在皮質(zhì)深層至淺層，每隔20張連續(xù)切片選取一張切片，共計(jì)26個(gè)平面。樹(shù)脂倒扣再包埋，半薄切片，進(jìn)行連接小管3種細(xì)胞特異性膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的免疫組織化學(xué)染色，即，水通道蛋白2（aquaporin2，AQP-2）、鈉氯同轉(zhuǎn)運(yùn)體(Natrium chlorinumcotransporter，NCC)和質(zhì)子ATP酶(H-ATPase)，分析連接

7、小管不同水平的細(xì)胞組成。免疫組化的主要步驟為KOH甲醇溶液蝕刻樹(shù)脂，甲醇與梯度乙醇水化切片，H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；抗原修復(fù)，一抗孵育4℃過(guò)夜，PBS沖洗后二抗孵育；DAB顯色；蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片；光鏡下觀察（Nikon，80i，日本）。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1、連接小管的空間走行及長(zhǎng)度
　　 在皮質(zhì)髓放線中，每條集合管在皮質(zhì)淺層接收6～7個(gè)腎單位的連接小管。其中1或2條為長(zhǎng)髓襻腎單位，其余為

8、短髓襻腎單位。來(lái)自于長(zhǎng)髓襻腎單位的連接小管起于位于皮質(zhì)深層或中層的遠(yuǎn)曲小管末端，在中層和淺層皮質(zhì)迷路內(nèi)弓狀上行，形成弓形管，途中有來(lái)自于淺表或中層皮質(zhì)的短髓襻腎單位的連接小管加入。最終，弓形管在淺層皮質(zhì)近被膜處返折，返折后不再有連接小管加入，并移行為集合管。來(lái)自于短髓襻腎單位的連接小管，除了在自身起源的腎小體附近的皮質(zhì)迷路內(nèi)上行，并與弓形管匯合，也有少數(shù)來(lái)自于最淺層皮質(zhì)短髓襻腎單位的連接小管在近被膜下直接與集合管相連。但是，走行在被膜下

9、的連接小管一般不直接接觸被膜，其間隔常常是一條近端小管。幾乎所有集合管從淺表皮質(zhì)到髓質(zhì)不再接收連接小管，在皮髓質(zhì)交界處集合管開(kāi)始與相鄰集合管匯合。
　　 來(lái)自于皮質(zhì)不同平面的腎單位的CNT走行長(zhǎng)度因向上走行的距離差異很大，很難用平均值來(lái)表示，尤其是來(lái)自于深層皮質(zhì)腎單位的CNT和弓形管。來(lái)自于淺表和中層皮質(zhì)短髓袢的CNT長(zhǎng)度范圍為150～500μm，而來(lái)自于深層或中層皮質(zhì)長(zhǎng)髓袢的CNT上升形成的弓形管長(zhǎng)度范圍為700～1200μm

10、。
　　 2、細(xì)胞成分分析
　　 根據(jù)免疫組織化學(xué)染色和細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征，連接小管由四種細(xì)胞成分組成：遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞、主細(xì)胞和閏細(xì)胞（集合管上皮細(xì)胞），以及連接小管自身特征細(xì)胞，即連接小管細(xì)胞。樹(shù)脂切片免疫組化結(jié)果顯示，無(wú)論長(zhǎng)髓襻還是短髓襻，連接小管細(xì)胞分布于小管全程，遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞只出現(xiàn)在連接小管的起始段；閏細(xì)胞出現(xiàn)較早并分布在連接小管的全長(zhǎng)；主細(xì)胞在長(zhǎng)髓襻腎單位連接小管出現(xiàn)較晚，主要分布在連接小管近集合管處。主細(xì)胞在短髓襻

11、腎單位的連接小管出現(xiàn)較早。
　　 結(jié)論：
　　 1、腎單位只在皮質(zhì)淺層或經(jīng)CNT，或經(jīng)弓形管匯入集合管系，集合管在穿過(guò)中層和深層皮質(zhì)時(shí)不再有新的腎單位加入，提示集合管從皮質(zhì)淺層接收腎單位輸送的濾過(guò)液后，在整個(gè)下行過(guò)程中不再接受其它腎單位的濾液，濾液離子濃度穩(wěn)定，重吸收功能不受其它腎單位影響。
　　 2、連接小管4種細(xì)胞成分分布呈一定的規(guī)律性。由于連接小管細(xì)胞和遠(yuǎn)曲小管細(xì)胞都有重吸收Na的功能，因而，連接小管對(duì)Na