肝螺桿菌甲基基團接受趨化信號轉導蛋白的克隆表達純化及血清學應用.pdf

1、目的和意義： 克隆肝螺桿菌（Helicobacter hepaticus，Hh）甲基基團接受趨化信號轉導蛋白（methyl-accepting chemotaxis signal transduction protein，MCP）基因，制備MCP重組蛋白作為抗原，從而制備ELISA檢測試劑盒檢測Hh感染者血清中的特異性免疫球蛋白，為檢測我國人群肝螺桿菌感染率及探討人類肝臟疾病和腸道非特異性炎癥的病因提供實驗基礎。 材料和

2、方法： 1、主要材料：肝螺桿菌菌株，原核表達質粒pET22b（+），抗His單克隆抗體，空腸彎曲菌選擇性血瓊脂培養(yǎng)基，鎳親和層析柱，辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG，辣根過氧化物酶標記山羊抗人IgG。 2、方法 2.1引物設計 根據(jù)GenBank選取肝螺桿菌基因HH1088中的一段長為255bp的保守區(qū)基因片段（即MCP），利用PrimerPremier5.0設計引物，上游（C255F）5’GACGAA

3、TTCCGTAGAGCAAGGGGATTTC3’（含EcoRⅠ酶切位點），下游（C255R）5’CGCCTCGAGTCTTTGTTTGAGCATTTT3’（含XhoⅠ酶切位點），以肝螺桿菌全基因組為模板，進行PCR擴增。 2.2MCP基因原核表達質粒的構建 肝螺桿菌保種菌液（由本實驗室保存）取100μl涂布于空腸彎曲菌選擇性血瓊脂培養(yǎng)基（含7%凍融脫纖維羊血，選擇性抗生素萬古霉素10mg/L，多粘菌素B2500單位/L，

4、二性霉素B10mg/L，TMP5mg/L），37℃微需氧條件（5%O210%CO2及85%N2）下培養(yǎng)，每天觀察有無菌落生長。將透明、針尖大小的菌落用棉簽刮至EP管中，PBS沖洗三次后，用細菌基因組DNA提取試劑盒提肝螺桿菌DNA。以肝螺桿菌全基因組DNA為模板，用Hotstart酶進行PCR擴增，反應條件為94℃30min總變性，94℃30s，50℃30s，72℃45s，共35個循環(huán)，72℃10min總延伸。所得目的片段回收后在限制性

5、內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ作用下37℃水浴1小時進行酶切反應，插入至原核表達載體pET22b（+）的EcoRⅠ和XhoⅠ之間，所得質粒命名為pET22b+/MCP，經酶切及PCR鑒定后進行測序。 2.3MCP基因在大腸桿菌中的表達 將重組質粒pET22b+/MCP轉化大腸桿菌感受態(tài)BL21（DE3），挑單克隆接種于10ml含氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基，37℃200rpm培養(yǎng)3個半小時至OD600約為0.6-1

6、.0。轉接100μl于10ml含氨芐青霉素100μg/ml的LB培養(yǎng)基中，37℃200rpm培養(yǎng)1個半小時至OD600約為0.6，加入500mmol/LIPTG至終濃度為1mmol/L，37℃180rpm培養(yǎng)4個小時。將誘導菌液12000rpm4℃離心5min，取1ml菌液沉淀進行SDS-PAGE鑒定。重組蛋白rhMCP包含表達載體pET22b（+）中的6×His標簽，因此用Westernblot對rhMCP的表達再次進行鑒定。

7、 2.4rhMCP蛋白的純化 取1000ml誘導表達的菌液，12000rpm4℃離心5min，菌體沉淀加入1/20細菌生長體積的細菌裂解液和PMSF，冰上超聲破碎細菌，10000rpm4℃離心15min。棄上清，往沉淀中加入1/20細菌生長體積的UrNTA-0Buffer和PMSF，將細胞懸浮，室溫放置30min，10000rpm4℃離心15min，取上清。用30ml的UrNTA-0Buffer平衡3mlNTA層析柱，上清液上柱

8、，收集穿透部分，用于SDS-PAGE分析蛋白質的結合情況。15mlUrNTA-0Buffer洗脫未結合部分，然后分別用15mlUrNTA-20，UrNTA-40，UrNTA-60，UrNTA-100，UrNTA-200，UrNTA-500洗脫，收集洗脫液，用SDS-PAGE確定目標蛋白質在洗脫液中的分布情況。用梯度PBS-尿素4℃透析（6M-4M-2M-1M），每4小時換液一次，最后用PBS4℃透析24小時。BCA法測蛋白濃度，-70℃

9、保存。 2.5小鼠H.Hepaticus感染血清學分析 購買裸鼠21只，其中出生2-3天的乳鼠9只；NIH孕鼠2只，其后解剖NIH悉生鼠24只，NIH普通小鼠6只（均購于南方醫(yī)科大學動物中心），一方面取結腸組織提取基因組DNA后，以C255F/C255R特異性引物進行PCR擴增，所得PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，陽性者進一步測序鑒定；另一方面經心臟或頸動脈取血，血液置于EP管中室溫靜置2小時，2000rpm

10、離心15min后取血清，-80℃保存。在棋盤滴定法確定最佳包被濃度和樣品最佳稀釋度后，以純化的蛋白rhMCP5μg/ml包被酶標板，每孔200μl，設復孔，4℃過夜；次日順序加入1：100稀釋的小鼠血清、HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1：10000稀釋）、最后加入底物OPD顯色，終止反應后用酶標儀進行雙波長測定OD492（OPD敏感波長）和OD630（非敏感波長，可消除孔底指痕、污物的影響）。最終的樣品OD值為樣品OD值（OD492-O

11、D630）與空白孔（只加底物和終止液）的差值。 2.6人類H.Hepaticus感染的ELISA血清學檢測臨界值判定 選取2008年12月至2009年3月期間在我院消化科確診的住院病人，共收集50例患者糞便標本和血清標本作為病例組，其中肝臟疾病10例（包括肝炎后肝硬化8例，肝癌2例），結腸癌10例，腸道潰瘍性病變10例（包括克羅恩病4例，潰瘍性結腸炎6例），十二指腸潰瘍9例，胃部疾病11例（包括單純性胃炎6例，胃癌5例）

12、；從正常人群中選取9例作為正常對照組。糞便標本提取組織DNA后，以C255F/C255R特異性引物進行PCR擴增，所得PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，陽性者進一步測序鑒定；所收集血清標本進行ELISA分析，結合糞便PCR結果確定cutoff值。 2.7利用ELISA血清學檢測方法初步探討人類H.Hepaticus感染情況 選取2007年11月至2009年3月期間在南方醫(yī)院消化科確診的220例住院病人，其中肝臟

13、疾病62例（包括肝炎后肝硬化33例，肝癌29例），結腸癌26例，腸道潰瘍性病變36例（包括克羅恩病15例，潰瘍性結腸炎21例），腸道感染性及增生性病變33例（包括腸炎8例，腸息肉23例，腸結核2例），十二指腸潰瘍16例，胃部疾病41例（包括單純性胃炎23例，胃癌18例），其它腫瘤5例；從正常人群中選取13例作為正常對照組。收集血清標本進行ELISA分析，以確定的cutoff值判定陽性與陰性結果。 2.8數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析

14、采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析，均數(shù)用M±SD表示，配對計數(shù)資料和多個樣本率的比較采用X2檢驗，顯著性水準（significantlevel）α=0.05，P<0.05認為結果有顯著性差異。 結論： 本研究通過分子克隆技術，在原核表達系統(tǒng)中成功構建MCP的原核表達質粒pET22b+/MCP，并利用IPTG誘導表達、分離純化獲得了MCP的純化重組蛋白rhMCP。以rhMCP作為檢測抗原，以糞便PCR方法做為金標準，通