熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)診斷甲型副傷寒的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：通過觀察血培養(yǎng)、Widal reaction（肥達(dá)反應(yīng)）、脂多糖-被動(dòng)血凝試驗(yàn)（LPS-PHA）及熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在臨床高度懷疑為甲型副傷寒沙門菌感染發(fā)熱患者中的檢出陽(yáng)性率，初步探討熒光定量PCR早期診斷甲型副傷寒的臨床價(jià)值，并評(píng)價(jià)熒光定量PCR特異性、敏感性和可重復(fù)性。 方法： （1）采用硅膠材料制成的HiBind膜基質(zhì)結(jié)合離心柱技術(shù)對(duì)甲、乙、丙型副傷寒沙門菌、傷寒沙門菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌及

2、福氏志賀菌七株標(biāo)準(zhǔn)菌株，分別提取DNA。再分別加入甲型副傷寒沙門菌鞭毛抗原基因序列的特異性引物及探針，相同條件下同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。并進(jìn)行敏感性及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。 （2）30例臨床高度懷疑為甲型副傷寒的發(fā)熱患者為甲型副傷寒組，分別進(jìn)行血培養(yǎng)、肥達(dá)反應(yīng)、LPS-PHA及熒光定量PCR四種方法檢測(cè)。11例明確為其它原因?qū)е掳l(fā)熱的患者為對(duì)照組，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。將甲型副傷寒以1×105Copies/ml分為高DNA載量組和低

3、DNA載量組，比較兩組與血培養(yǎng)、肥達(dá)反應(yīng)及LPS-PHA結(jié)果的關(guān)系。 結(jié)果：（1）七株標(biāo)準(zhǔn)菌株中僅甲型副傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株熒光定量PCR結(jié)果為陽(yáng)性，而其他非甲型副傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株結(jié)果均為陰性。甲型副傷寒沙門菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA經(jīng)過逐級(jí)倍比稀釋后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，最低檢測(cè)下限達(dá)1×102Copies/ml。將1×108、1×107、1×106Copies/ml三個(gè)梯度每個(gè)梯度重復(fù)三次進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示1×106C

4、opies/ml：22．22±0．50；1×107Copies/ml：17．49±0．34；1×108Copies/ml：12．69±0．18。（2）熒光定量PCR檢測(cè)30例高度懷疑為甲型副傷寒發(fā)熱患者，22例為陽(yáng)性，對(duì)照組中11例均為陰性。兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0．000）。甲型副傷寒組30例患者通過四種方法檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率分別為27％（8/30）、23％（7/30）、17％（5/30）和73％（22/30）。熒光定量PCR與血

5、培養(yǎng)、肥達(dá)反應(yīng)、LPS-PHA間比較差異有顯著性（均P<0．0083），而血培養(yǎng)、肥達(dá)反應(yīng)、LPS-PHA間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0．0083）。 （3）對(duì)病程第1周的12例患者進(jìn)行四種方法分析，陽(yáng)性檢出率分別為25％（3/12）、17％（2/12）、17％（2/12）和67％（8/12），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，四種方法差異有顯著性（P<0．05）。 結(jié)論：熒光定量PCR是一種快速、敏感和特異的診斷方法，優(yōu)于血培養(yǎng)、肥達(dá)反應(yīng)、