視網(wǎng)膜Nogo氨基末端信號(hào)通路的初步研究.pdf

1、數(shù)目眾多的各種先天和后天性疾病可使中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累,而損傷對(duì)神經(jīng)元及其軸突造成的破壞幾乎不可逆,因?yàn)樵谥袠猩窠?jīng)絕大多數(shù)區(qū)域內(nèi)成年哺乳動(dòng)物幾乎沒有更換丟失或?yàn)l死神經(jīng)元的能力,而僅有極其微弱的神經(jīng)纖維修復(fù)作用。故此區(qū)域內(nèi)的創(chuàng)傷性或血管性損傷,和因慢性退行性疾病造成的神經(jīng)元丟失、神經(jīng)纖維束損傷,破壞神經(jīng)回路的完整性,將造成長期的功能障礙。中樞神經(jīng)損傷后的再生修復(fù),特別是在損傷較重,或慢性損傷的情況下,尤為困難。目前的研究普遍認(rèn)為,中樞神經(jīng)損傷

2、后再生受限,主要是因?yàn)槭艿搅似渌枇字蠳ogo蛋白的抑制。
　　 nogo基因編碼三種異構(gòu)體,Nogo-A,Nogo-B和Nogo-C。三種異構(gòu)體的羧基端結(jié)構(gòu)相同,由188個(gè)氨基酸組成,含有兩個(gè)長疏水結(jié)構(gòu)域,和位于這兩個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域之間的一個(gè)短的66個(gè)氨基酸構(gòu)成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)域,Nogo-66。在多種神經(jīng)元都有廣泛表達(dá)的糖蛋白NgR,被認(rèn)為是Nogo-66結(jié)構(gòu)域的受體。NgR是一種細(xì)胞表面GPI鏈接蛋白,但因缺乏細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域需要p75

3、或TROY作為共受體介導(dǎo)通過細(xì)胞膜的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),后兩者均是屬于腫瘤壞死因子受體家族的跨膜蛋白。另一共受體,LINGO-1,作為銜接蛋白也是Nogo信號(hào)傳遞過程中所必須的。而另外兩種髓磷脂抑制因子,MAG和Omgp對(duì)NgR也有很強(qiáng)的親和力。說明三種不相關(guān)的髓磷脂抑制因子,Nogo、MAG和Omgp,經(jīng)由同一復(fù)合受體,并共享相同的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑。
　　 雖然目前廣為接受Nogo及其受體NgR的相互作用,對(duì)成年哺乳動(dòng)物損傷后中樞神經(jīng)軸突

4、的再生發(fā)揮了主要的抑制作用,但仍有眾多的疑問。因?yàn)橛匈Y料證實(shí)脊髓損傷后,NgR基因敲出的小鼠皮質(zhì)脊髓束神經(jīng)元仍然不能再生;在不結(jié)合NgR的情況下,Nogo-A氨基末端也可抑制神經(jīng)元軸突的生長。此外,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元NgR的表達(dá)很弱,其他脊髓神經(jīng)元根本不表達(dá)。各種初級(jí)感受神經(jīng)元均無NgR的高表達(dá),有些甚至不表達(dá)。如果在中樞神經(jīng),NgR是Nogo發(fā)揮軸突生長抑制作用的基本神經(jīng)元受體,那么各種神經(jīng)元NgR顯著的表達(dá)差異,將限制對(duì)Nogo-66生長抑

5、制作用敏感神經(jīng)元的范圍,實(shí)際情況又非如此。關(guān)于NgR在小腦浦肯野神經(jīng)元是否表達(dá),以及脊髓中NgR的分布情況也一直存在爭議。而中和Nogo-66活性結(jié)構(gòu)域作用僅獲得損傷軸突的有限再生,即便2008年及2009年又分別發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的作用于Nogo-66結(jié)構(gòu)域的受體,PirB和GPR50,使得Nogo發(fā)揮軸突生長抑制作用的途徑,仍然存在未解之謎。
　　 此外,Nogo及其Nogo-66活性結(jié)構(gòu)域經(jīng)典受體NgR在視覺系統(tǒng)的表達(dá)研究也寥寥

6、無幾。而視覺系統(tǒng)因具有:視網(wǎng)膜神經(jīng)解剖明確的,有已被研究較為透徹的七種主要細(xì)胞和一條通路;節(jié)細(xì)胞通過玻璃體腔內(nèi)注射就能被直接定向;網(wǎng)膜的功能可通過無創(chuàng)定量技術(shù)評(píng)估;視神經(jīng)是源于白質(zhì)中央部分的分離束,在眼眶內(nèi)就能被接觸到;損傷后,節(jié)細(xì)胞的存活情況和軸突再生的數(shù)量易定量;由于其特征性的解剖和功能構(gòu)成,可通過檢測(cè)再生節(jié)細(xì)胞軸突的連接和形態(tài),評(píng)估神經(jīng)塑形和修復(fù)后的功能等優(yōu)勢(shì),廣泛被用于損傷中樞神經(jīng)的再生修復(fù)研究。因此對(duì)視覺通路Nogo及NgR的

7、分布研究,不僅有助于研究中樞神經(jīng)損傷后的再生修復(fù),對(duì)探討Nogo-NgR作用也有極大的幫助。
　　 2008年Yale大學(xué)Hu等對(duì)多種細(xì)胞的研究結(jié)果表明,Nogo-A另一個(gè)不同于Nogo-66結(jié)構(gòu)域的活性位點(diǎn),氨基末端結(jié)構(gòu)域(Nogo氨基末端)極有可能通過整合素對(duì)細(xì)胞發(fā)揮作用,并鑒定出對(duì)Nogo氨基末端敏感的整合素為av,a5,和a4,但在他們的實(shí)驗(yàn)中,僅涉及雞的背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元,并未對(duì)其他種類神經(jīng)元進(jìn)行研究,雖然,整合素av和

8、a5在CNS是存在廣泛表達(dá)的,但雞視網(wǎng)膜中沒有整合素a5的表達(dá),而人類的視網(wǎng)膜中沒有整合素av的表達(dá),這些又對(duì)Nogo氨基末端信號(hào)通路產(chǎn)生了新的疑問。
　　 因此,本研究的目的在于,探討視覺通路Nogo及其Nogo-66活性結(jié)構(gòu)域經(jīng)典受體NgR的分布情況,為研究中樞神經(jīng)損傷后的再生修復(fù),及Nogo-NgR作用奠定理論基礎(chǔ);對(duì)視網(wǎng)膜Nogo氨基末端是否存在整合素結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行初步探討,推測(cè)是否可能存在新的Nogo信號(hào)途徑,從而為臨床

9、中樞神經(jīng)損傷后的修復(fù)研究提供新的思路。
　　 據(jù)此,本課題進(jìn)行了以下兩個(gè)方面的研究:1、對(duì)大鼠雙眼視神經(jīng)橫斷前后視覺通路中Nogo與NgR的分布及表達(dá)的變化進(jìn)行研究;2、通過共區(qū)域化表達(dá)、免疫共沉淀等研究,初步探討了視網(wǎng)膜Nogo氨基末端是否存在整合素結(jié)合位點(diǎn)。
　　 主要結(jié)果與結(jié)論如下:
　　 1、在新生大鼠視網(wǎng)膜、外側(cè)膝狀體和視皮質(zhì)區(qū)都存在Nogo蛋白及NgR蛋白的表達(dá),這為Nogo蛋白可能參與視覺通路的建立

10、,軸突的塑形、導(dǎo)向提供了證據(jù)。由于在沒有NgR的情況下,Nogo仍然可發(fā)揮相應(yīng)的作用,例如可直接作用于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng),通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子的濃度改變局部微環(huán)境影響細(xì)胞的遷移、軸突的延長以及對(duì)生長錐進(jìn)行導(dǎo)向。因此在Nogo和NgR共同出現(xiàn)時(shí),Nogo是否一定通過共區(qū)域化的NgR發(fā)揮作用,尚需進(jìn)一步的研究。
　　 2、包括視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、視交叉、視束、外側(cè)膝狀體和視皮質(zhì)在內(nèi)的成年大鼠視覺通路內(nèi)都存在Nogo和NgR的表達(dá)。視束和外側(cè)

11、膝狀體在視神經(jīng)橫斷傷后Nogo的變化規(guī)律相近,傷后升高并保持該高水平直至傷后14d,而兩者及視神經(jīng)的NgR在損傷后的改變相似,基本不發(fā)生變化。雙眼視神經(jīng)完全橫斷后視網(wǎng)膜中幾乎觀察不到Nogo和NgR的表達(dá)。視神經(jīng)在損傷后Nogo蛋白呈現(xiàn)出逐漸持續(xù)升高的趨勢(shì)。視交叉直到損傷后的14d才觀察到有Nogo的減少,而NgR在損傷后就下降并一直保持在此低水平直至傷后14d。視皮質(zhì)內(nèi)的Nogo雖然在損傷后會(huì)一直較多,但傷后14d的水平要明顯低于傷后

12、7d,NgR傷后雖一直較少,但傷后14d較7d相比要顯著增多。因此我們推測(cè),在視神經(jīng)、視束、外側(cè)膝狀體由于Nogo和NgR兩種蛋白的變化規(guī)律似乎和Nogo-NgR作用不沖突,此三個(gè)區(qū)域內(nèi)的Nogo有可能部分通過NgR受體發(fā)揮作用,而其他區(qū)域內(nèi)Nogo的作用機(jī)制可能更加復(fù)雜。
　　 3、通過共區(qū)域化表達(dá)、免疫共沉淀等研究結(jié)果表明,在成年哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜中,Nogo-A氨基末端結(jié)構(gòu)域,即Nogo氨基末端存在整合素av的結(jié)合位點(diǎn)。這說