神經元Nogo-A分子信號與功能的初步研究.pdf

1、髓鞘來源的中樞神經再生抑制因子—Nogo-A 自2000年被克隆以來，其抑制神經再生的機制已經被廣泛研究?，F在知道，寡突膠質細胞上表達的Nogo-A 通過神經元表面的NgR/ p75NTR（或者TROY）/LINGO-1 受體復合物抑制神經元突起的生長。雖然目前有很多實驗室利用在體和體外干預實驗來封閉與Nogo 相關的抑制信號，并取得了比較顯著的神經突起生長和神經再生。但是，2003年Schwab、Strittmatter和Tessie

2、r-Lavigne 三家實驗室利用不同的基因敲除策略進行了Nogo基因剔除的實驗，并沒有得到一致證據支持Nogo 與中樞神經再生的直接關系。 在中樞神經系統中，Nogo-A 不僅高表達于成熟的少突膠質細胞，而且在多種類型的神經元中也廣泛表達。我們實驗室以前的研究顯示神經元表達的Nogo-A蛋白除少量定位于細胞膜上，主要定位于內質網、多聚核糖體和細胞核內的染色質上，提示Nogo-A 可能與某些神經元的功能有關。通過Nogo-A蛋白

3、的一級結構分析發(fā)現，Nogo-A的氨基端不僅存在潛在的核進入位點，還富含酸性氨基酸和多個可能與很多帶WW、SH3 結構域的信號分子相互作用的脯氨酸豐富（Proline Rich）結構，提示Nogo-A 很有可能作為重要的調節(jié)蛋白參與神經元中的轉錄調控。 作為揭示Nogo-A 神經元功能的系列研究的一部分，本課題主要以人胚胎腎細胞系HEK293FT為模型來研究Nogo-A 可能調節(jié)的下游轉錄信號及其機制，并在此基礎上利用PC12細

4、胞分化模型初步研究Nogo-A 對神經元分化和突起生長的調節(jié)作用。主要獲得的結果如下：（一）在HEK293FT細胞系中，利用信號途徑報告基因系統篩選過表達Nogo-A 對多種信號途徑的調控作用時，發(fā)現Nogo-A 能特異激活NF-κB 信號，并且Nogo-A 對NF-κB 信號的激活是Nogo-A 劑量依賴的。（二）利用不同的Nogo-A 剪接體和截斷體形式研究證明Nogo-A 激活NF-κB 信號依賴于其氨基端的Proline R

5、ich 結構域。（三）進一步使用NF-κB 信號途徑相關分子顯性突變體揭示IκB α、TRAF6、Rac/Cdc42 參與Nogo-A 激活NF-κB 信號。（四）利用純化的GST-NogoA 截斷體蛋白胞外作用HEK293細胞，發(fā)現它們對細胞內的NF-κB 活性沒有明顯的影響，提示Nogo-A對NF-κB 信號的激活不是通過分泌到細胞外的蛋白片段作用于相應受體介導的。（五）利用RNAi 技術下調PC12細胞中Nogo-A的表達，

6、可以有效的抑制NGF 誘導PC12細胞分化過程中NF-κB 信號的激活。（六）觀察到在PC12細胞中瞬時過表達NogoA，NGF 誘導3天后發(fā)現過表達Nogo-A 對NGF 誘導PC12 分化和突起生長并沒有影響；我們同時構建了穩(wěn)定表達PMIR-Nogo-A和對照載體PMIR-Control的PC12細胞系，NGF 誘導后發(fā)現下調PC12 中Nogo-A的表達對NGF 誘導PC12 分化也沒有影響。 結果提示，Nogo-A 可