視網(wǎng)膜母細胞瘤血管生成擬態(tài)的初步研究.pdf

1、目的：探討人視網(wǎng)膜母細胞瘤(Retinalblastoma，RB)中血管生成擬態(tài)(Vesculogenicmimicry，VM)的存在與否；在體外通過三維培養(yǎng)，探討缺氧在誘導(dǎo)RB細胞向內(nèi)皮樣細胞轉(zhuǎn)化及VM形成中的作用；并利用RNA干擾(RNAi)技術(shù)構(gòu)建針對缺氧誘導(dǎo)因子-1α（HIF-1α）的shRNA慢病毒載體，研究HIF-1α在RB細胞(Y79)形成VM中的調(diào)控作用。
　　 方法：1．收集人RB臨床標(biāo)本，石蠟切片，HE染色、

2、PAS/CD34雙重染色觀察RB中是否存在VM，及擬態(tài)血管密度(VMD)與腫瘤分期及分化程度的關(guān)系；采用免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤干細胞標(biāo)記物ABCG2、內(nèi)皮細胞標(biāo)記物AC133、特異性低氧反應(yīng)元件HIF-1α及其下游因子EphA2、MMP-2的表達。2．利用商品化的慢病毒載體Lentivirus構(gòu)建針對HIF-1α的shRNA病毒載體，轉(zhuǎn)染Y79細胞，72h后在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，新霉素抗性篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的Y79細胞，West

3、enblot及逆轉(zhuǎn)錄PCR的方法分別檢測HIF-1α蛋白及mRNA的表達。3．在體外對Y79細胞進行缺氧培養(yǎng)；倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的改變；通過Dil吞噬實驗及免疫熒光檢測內(nèi)皮細胞標(biāo)記物AC133的表達從而對由腫瘤細胞誘導(dǎo)而成的內(nèi)皮樣細胞進行鑒定；免疫熒光顯微鏡檢測腫瘤干細胞與內(nèi)皮樣細胞的關(guān)系；通過三維培養(yǎng)觀察VM的形成能力；Westernblot及熒光定量PCR的方法檢測HIF-1α、EphA2、MMP-2的表達。
　　 結(jié)

4、果：1．在收集的33例人視網(wǎng)膜母細胞瘤石蠟標(biāo)本中19例可見PAS陽性而CD34陰性的VM結(jié)構(gòu)，統(tǒng)計分析結(jié)果顯示未分化型RB的VM陽性率明顯高于分化型，而各分期之間VM陽性率無明顯差異。免疫組化結(jié)果顯示：有VM存在的RB組織中可見部分腫瘤細胞ABCG2、AC133陽性表達且分布與VM的走形一致；統(tǒng)計分析結(jié)果顯示：有VM組ABCG2、AC133陽性細胞百分比明顯高于無VM組，并且HIF-1α、EphA2、MMP-2的表達也明顯高于無VM組。

5、2．陽性克隆PCR結(jié)果及測序結(jié)果均顯示：針對HIF-1α的shRNA病毒載體構(gòu)建成功；利用該病毒載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)染Y79細胞后未見明顯的細胞毒性，抗性篩選出的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞其HIF-1α的蛋白及mRNA表達幾乎被完全沉默。3．在體外缺氧培養(yǎng)后，部分Y79細胞失去懸浮生長的特性開始貼壁生長，呈長梭形或多邊形；實驗顯示這些貼壁的細胞具有吞噬Dil-acLDL的功能并能表達AC133;在三維培養(yǎng)基上缺氧能誘導(dǎo)Y79細胞形成網(wǎng)格狀VM結(jié)構(gòu)；Wester

6、nblot及熒光定量PCR結(jié)果顯示：缺氧使Y79細胞HIF-1α及其下游因子EphA2、MMP-2的表達明顯增加。而在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HIF-1αshRNA的Y79細胞中未能觀察到缺氧引起的上述變化。
　　 結(jié)論：1．低分化的RB組織中存在VM，且VM的密度與分化程度呈反比與臨床分期無關(guān)。2．設(shè)計構(gòu)建的HIF-1α,shRNA慢病毒載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Y79細胞后可以有效地實現(xiàn)對相應(yīng)的內(nèi)源性HIF-1αmRNA的降解。3．缺氧是RB血管生成擬態(tài)