Cyclin B1反義全長cDNA誘導細胞周期阻滯及抑制成瘤性的實驗研究.pdf

1、研究背景與目的：細胞周期蛋白B1(CyclinB1)為有絲分裂期(M期)細胞周期蛋白，與細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK1)結合形成成熟促進因子(muturiorpromotingfactor,MPF)，MPF的激活為真核細胞啟動有絲分裂所必需，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用；CyclinB1在許多腫瘤細胞系均高表達，其高表達被視為腫瘤具有惡性潛能的標志之一。反義cDNA是反義技術中一種簡便有效

2、的下調靶基因的方法，但目前尚未見應用該方法靶向CyclinB1基因抗腫瘤治療的相關報道。 方法：構建含有小鼠CyclinB1反義全長cDNA的重組質粒(pAS-mCLB1)并將pAS-mCLB1及空載體pcDNA3.1(+)分別轉染小鼠Lewis肺癌(LL/2)和CT26結腸癌細胞系(CT26)，建立了AS-mCLB1及pcDNA3.1(+)穩(wěn)定轉染子(Ac及Pc細胞)；通過流式細胞儀檢測Ac、Pc及未經(jīng)轉染(Nc)細胞的細胞周

3、期分布及凋亡；分別用兩步法半定量RT-PCR及Westernblot比較上述三種細胞中mCyclinB1的mRNA及蛋白含量；MTT及細胞生長實驗用于檢測細胞增殖活性；在小鼠體內(nèi)分別接種上述三種細胞，觀察細胞在體內(nèi)的成瘤性及荷瘤小鼠的生存時間；然后對Ac與Nc組的細胞及動物血清進行蛋白組學差異分析；免疫組化檢測Ac、Pc及Nc組動物腫瘤組織mCyclinB1的蛋白表達，凋亡染色了解腫瘤組織內(nèi)細胞凋亡率。 結果：Ac細胞與兩對照(

4、Nc及Pc)細胞相比，mCyclinB1的mRNA及蛋白含量顯著下降，出現(xiàn)明顯的細胞凋亡、G1期阻滯及異常的細胞形態(tài)，細胞增殖也受到明顯抑制。另外，接種LL/2/Ac細胞的C57BL/6小鼠在接種后第9天成瘤，而兩對照組第5天就已成瘤；同樣，接種CT26/Ac細胞的BALB/C小鼠在接種后第6天成瘤，而兩對照組第3天就已成瘤。而且，兩種腫瘤模型Ac組的生存時間均較其對應的兩對照組顯著延長。無論是細胞還是動物血清，在Ac及Nc組之間蛋白組

5、學均存在顯著差異。免疫組化染色提示Ac組腫瘤組織中mCyclinB1蛋白表達明顯下調，凋亡染色顯示該組腫瘤組織細胞凋亡率增加。 結論：本研究首次報道了用AS-CLB1靶向腫瘤細胞的CyclinB1基因，闡明了該基因活性下調的腫瘤細胞的生物學特性，證實了AS-CLB1通過降低腫瘤細胞CyclinB1基因表達，誘導細胞發(fā)生G1期阻滯及凋亡，從而抑制腫瘤細胞體內(nèi)外增殖活性的高效性，為抗腫瘤生物治療提供了一條極有潛力的新策略。