骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)合多肽自組裝支架材料治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本研究分為三部分：
　　 第一部分：移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：研究體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的表達(dá)，以及移植后對(duì)大鼠脊髓損傷的治療作用。
　　 方法：取大鼠骨髓，用全骨髓貼壁法分離MSCs，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD90、CD44和CD45等抗原的表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)MSCs中腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF

2、）mRNA的表達(dá)，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測(cè)其BDNF和NGF蛋白的表達(dá)。用改良Allen重物打擊法造大鼠脊髓損傷模型，1周后將MSCs注射到損傷部位，術(shù)后4周每周進(jìn)行BBB評(píng)分，術(shù)后第4周取損傷部位脊髓組織，ELISA檢測(cè)組織中BDNF和NGF的表達(dá)；另取損傷部位脊髓組織進(jìn)行NF200和GFAP免疫熒光染色。
　　 結(jié)果：MSCs貼壁生長(zhǎng)，呈紡錘形及梭形，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表達(dá)CD90、CD44，不表達(dá)CD34和CD45，RT

3、-PCR發(fā)現(xiàn)其表達(dá)BDNF和NGFmRNA，且ELISA檢測(cè)到了BDNF和NGF蛋白的表達(dá)，移植MSCs的大鼠運(yùn)動(dòng)功能改善，BBB評(píng)分高于對(duì)照組；移植MSCs的脊髓組織中BDNF和NGF蛋白含量高于對(duì)照組；免疫熒光發(fā)現(xiàn)移植MSCs的大鼠脊髓囊腔較小，且周圍有較多軸突再生。
　　 結(jié)論：MSCs表達(dá)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF和NGF，移植后改善了局部微環(huán)境，能夠促進(jìn)大鼠脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。
　　 第二部分：多肽原位植入對(duì)大鼠

4、脊髓損傷治療作用的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的：設(shè)計(jì)合成兩親性多肽C16H31O-AGD342IKVAV，研究其自組裝形成的三維凝膠結(jié)構(gòu)，并研究其植入后對(duì)大鼠脊髓損傷的治療作用。
　　 方法：將兩親性多肽C16H31O-AGD342IKVAV用仿生體液促發(fā)自組裝，用透射電鏡（TEM）檢測(cè)。改良Allen植物打擊法造大鼠脊髓損傷模型，將多肽溶液注入損傷部位，術(shù)后6周每周進(jìn)行BBB評(píng)分；術(shù)后3d、1w、2 w、3 w、4 w、6w分

5、別取損傷部位脊髓組織，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）的表達(dá)；術(shù)后第6周取損傷部位脊髓組織，進(jìn)行NF200和GFAP免疫熒光染色。
　　 結(jié)果：多肽溶液在仿生體液促發(fā)下自組裝為三維凝膠，TEM顯示為納米纖維，直徑7-8nm，纖維空隙較大；術(shù)后第5周、第6周多肽注入組BBB評(píng)分高于對(duì)照組；實(shí)時(shí)定量熒光PCR顯示多肽組損傷部位GFAP表達(dá)低于對(duì)照組；免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)植入多肽組局部GFAP表達(dá)較少，且有較多軸突再生。

6、
　　 結(jié)論：兩親性多肽C16H31O-AGD342IKVAV能自組裝為三維凝膠，植入脊髓損傷大鼠能夠抑制GFAP形成，并能促進(jìn)軸突再生。
　　 第三部分：組織工程化神經(jīng)移植物的構(gòu)建
　　 目的：使用兩親性多肽自組裝三維凝膠作為支架材料，結(jié)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，構(gòu)建組織工程化神經(jīng)移植物。
　　 方法：將多肽溶液用MSCs細(xì)胞懸液促發(fā)自組裝，形成復(fù)合細(xì)胞的三維凝膠，光鏡觀察細(xì)胞的分布；培養(yǎng)1d、7d 及21d

7、，用鈣黃綠素和PI進(jìn)行活死細(xì)胞染色，觀察細(xì)胞在凝膠內(nèi)的存活情況；細(xì)胞凝膠復(fù)合物進(jìn)行培養(yǎng)，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖；ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中BDNF和NGF的表達(dá)。
　　 結(jié)果：細(xì)胞懸液促發(fā)了多肽溶液自組裝為三維凝膠，且細(xì)胞以三維形式存在于凝膠內(nèi)；活死細(xì)胞染色發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至21d大部分MSCs仍存活，細(xì)胞增殖測(cè)試發(fā)現(xiàn)MSCs在凝膠內(nèi)增殖良好，與二維培養(yǎng)無顯著性差異；ELISA發(fā)現(xiàn)凝膠中的MSCs產(chǎn)生并分泌了BDNF和NGF。