基因工程化的系膜細胞系移植在體外及體內(nèi)監(jiān)測急性腎小球腎炎.pdf

1、腎小球腎炎是慢性腎衰的常見原因之一。目前，沒有一種手段能夠連續(xù)性地、無侵襲性地評估腎小球腎炎。單核巨噬細胞系統(tǒng)在很多種類的腎小球腎炎的發(fā)病中都起重要作用1。在病理條件下，活化的巨噬細胞釋放出一系列的炎癥介質，導致腎小球損傷的起始和進展2。監(jiān)測巨噬細胞-系膜細胞間相互作用對于評估腎小球腎炎的活性和明了腎小球損傷的機制是很重要的。我們將kB增強子片段引導的分泌性堿性磷酸酶(SEAP)穩(wěn)定地導入系膜細胞。本研究的目的在于確定這個建立的系統(tǒng)能否

2、在體外監(jiān)測巨噬細胞一系膜細胞間的相互作用；將這個系膜細胞系移植到大鼠體內(nèi)后，它能否在體內(nèi)監(jiān)測局部的腎小球炎癥。 實驗方法： 克隆系膜細胞系SM43是從雄性SD大鼠的腎小球分離的。動物實驗全部采用清潔級成年雄性SD大鼠(日本山梨大學醫(yī)學部動物部)。主要儀器設備：Gene Light 55熒光照度儀，超凈臺，CO2細胞孵育器，CR5B2離心機，BAS-2500型放射自顯影機，電泳儀。主要試劑有SEAP檢測試劑盒，抗-Thy

3、1.1單克隆抗體1-22-311，pNFkB-SEAP質粒。主要藥物有IL-1β、TNF-α和MG132。 首先進行轉染，將pNFKB-SEAP質粒(5μg)和pcDNA3.1質粒(1μg)轉染5×105個SM43系膜細胞。上述質量與0.25M的CaCl2400μl混合，短時間快速振蕩，之后與2xBBS400μl混合并振蕩30分鐘到1小時，直到出現(xiàn)肉眼可見的沉淀物后，在4℃條件下放置約2到3小時。隨后將混合液轉入上述培養(yǎng)皿內(nèi)并攪

4、拌。約16小時后，更換培養(yǎng)液；24小時后，用濃度是330μg/ml的G418(一種新霉素)來選擇穩(wěn)定的轉染細胞，可引導性最高、背景影響最小的一個克隆被選出，以進行下面的細胞實驗。我們將該克隆命名為SM/NFkB-SEAPS。使用同樣的方法，用pSEAP2-對照質粒和pcDNA3.1質粒，我們又建立了SM/SV-SEAF28細胞系。pSEAP2-對照質粒編碼SV40早啟動子和增強子引導的SEAP。本實驗僅使用穩(wěn)定轉染的20代到35代細胞。

5、建立大鼠腎炎模型：在成年雄性SD大鼠(體重250-300克)，將1ml單克隆抗體1-22-3經(jīng)尾靜脈注入，建立抗-Thy 1.1腎小球腎炎模型。 篩網(wǎng)法分離腎小球：將正常大鼠或腎炎大鼠(抗體注入后第4天)的腎臟很好地研碎，序列地通過三個不銹鋼篩網(wǎng)，篩網(wǎng)的孔徑直徑分別是180、125、106μm,然后用0-4℃PBS收集腎小球。 細胞移植：1×106個已經(jīng)貼壁生長的SM/NFkB-SEAP5細胞被胰蛋白酶解離，放在1ml含

6、1％FBS的培養(yǎng)液內(nèi)，4℃放置。大鼠右側臥位，經(jīng)左側腹壁打開腹腔，分離出腎門血管，經(jīng)左腎動脈將細胞注入到正?；蚰I炎大鼠(腎炎后第一天)的腎臟內(nèi)。 腎小球腎炎的體內(nèi)監(jiān)測：將大鼠分為5組：1.正常大鼠、2.移植了感受細胞的正常大鼠、3.腎炎大鼠、4.移植了感受細胞的腎炎大鼠、5.腹膜細胞移植組。第1、3、6、8和10天從尾靜脈采血，然后分離血清，做SEAP分析。每組至少有4-6只大鼠。 實驗一首先用免疫熒光方法判定細胞的特性

7、；然后體外實驗觀察該細胞系監(jiān)測巨噬細胞-系膜細胞間的相互作用情況。主要用SEAP活性測定法檢測培養(yǎng)液中SEAP活性，Northern測定SEAP mRNA水平。 實驗二采用基因工程化的感受細胞系移植，在體內(nèi)監(jiān)測急性腎小球腎炎。主要用SEAP括性測定法檢測血清和培養(yǎng)液中SEAP活性，Northern測定SEAPmRNA水平。 實驗三以實驗一及實驗二的特殊發(fā)現(xiàn)為依據(jù)，利用共培養(yǎng)實驗和交互飼育實驗探求NF-kB信號途徑在體外培

8、養(yǎng)的正常腎小球是否自發(fā)性地活化，以及MAPK與NF-kB信號活化的關系。 統(tǒng)計學處理：以3孔細胞或4孔細胞為一組進行分析。大鼠分組則是4到6只為一組。資料的表示方法是平均值±標準誤。用非參數(shù)性Mann-Whitney U檢驗進行統(tǒng)計學分析。認為p<0.05具有統(tǒng)計學意義。 結果： 實驗一：建立的感受細胞在接受系膜細胞標記物抗α平滑肌肌動蛋白單克隆抗體(1:100)染色和抗Thy 1.1單克隆抗體(1:100)染色

9、時，呈陽性。在前炎性因子IL-1p刺激感受性系膜細胞時，Northern分析和SEAP活性測定都表明SEAP水平以時間和濃度依賴的方式增加。不同于KB增強子片段的刺激物IL-1(3和TNF-α,TRE的刺激物TPA,CRE的刺激物forskolin以及SRE的刺激物PDGF一BB都不能誘導出'SEAP水平的提高。在暴露于活化的巨噬細胞的感受細胞，Northern可以觀察到明顯的SEAP mRNA的誘導。同樣，可以在兩種細胞的共培養(yǎng)液中檢

10、測到顯著的SEAP活性(有巨噬細胞組80,318±2,365 RLU;沒有巨噬細胞組2,075±82 RLU，二者相比有明顯統(tǒng)計學差異)。這種誘導可以被NF -KB抑制劑MG132完全抑制(782±141 RLU，與巨噬細胞組相比，也有明顯統(tǒng)計學差異)。 實驗二：熒光顯微鏡下，通過DiI染色標記的方式，證明:在有感受細胞移植的左側腎臟分離的腎小球，可以明顯地看到感受細胞的積聚;而在沒有感受細胞移植的右側腎臟分離的腎小球，沒有看到

11、感受細胞的積聚。具體數(shù)據(jù)分析是:在有感受細胞移植的左腎，DiI陽性染色的腎小球的比例是90.8±2.9％。在沒有感受細胞移植的右腎，觀察不到陽性染色的腎小球，二者有明顯統(tǒng)計學差異。另一個克隆細胞系SM/SV一SEAP28細胞體內(nèi)移植后，血清SEAP分析顯示了血清中的SEAP水平以注人細胞數(shù)目依賴的方式升高。這說明SEAP可以在體內(nèi)被作為一個報告分子，而且可以從血清中檢測到。在SM/NFKB-SEAP5細胞移植實驗中，血清SEAP在第3到

12、6天達到最高值，隨后開始下降(3天時是基礎值的3.46±0.44倍，6天時是基礎值的3.47土0.85倍)。甚至于在細胞移植第10天以后，也可以從腎小球中再培養(yǎng)出許多新霉素耐受的感受細胞。而且，當向腎炎大鼠腹腔內(nèi)注射感受細胞時，并不能監(jiān)測到血清SEAP水平的升高，說明移植的細胞只能監(jiān)測局部的炎癥。如上的結果提示:用一種腎小球局部存在的生物感受系統(tǒng)選擇性并持續(xù)性地評估腎小球腎炎是可行的。 實驗三:在體外培養(yǎng)的正常的腎小球，可以發(fā)現(xiàn)

13、MCP-1的自發(fā)生成。共同培養(yǎng)和交互飼育實驗都顯示:分離的正常的腎小球自發(fā)地產(chǎn)生自分泌/旁分泌因子，促進SM43細胞MCP-1的生成。MG132明顯抑制MCP-1的生成。這說明MCP-1的誘導也是依賴于NF-κβ信號傳導途徑的。與SM/NFκβ-SEAP5系膜細胞系的共同培養(yǎng)和交互飼育實驗都顯示:體外培養(yǎng)的腎小球的確產(chǎn)生自分泌/旁分泌因子，這些因子激活NF-κβ信號傳導系統(tǒng)。當PD098059 (50 μM, ERK抑制劑)或SB203

14、580 (25 μM;p38MAPK抑制劑)存在于培養(yǎng)液中時，在感受細胞與腎小球共培養(yǎng)24小時以后，這兩種藥物都能明顯地降低來自于SM/NFκβ-SEAP5感受細胞的SEAP的分泌。 結論： 1.我們建立了一個基因工程化的感受細胞系，它可以在KB增強子的引導下，制造和分泌SEAP。當受到巨噬細胞產(chǎn)生的前炎性因子的刺激時，或直接受到活化的巨噬細胞的刺激時，可以觀察到SEAP分泌的明顯的升高。交互飼育研究表明:在培養(yǎng)液中存在

15、活化的巨噬細胞集聚的炎性腎小球釋放的可溶性因子的時候，感受細胞可以分泌SEAP。細胞移植研究表明感受細胞在活化的巨噬細胞存在的炎性腎小球內(nèi)分泌SEAP。我們的這些數(shù)據(jù)說明了這個建立的系統(tǒng)可以在體外監(jiān)測巨噬細胞一系膜細胞的相互作用。 2.當建立的系膜細胞系經(jīng)腎動脈被移植到患有腎炎的大鼠體內(nèi)后，血清SEAP水平明顯升高。血清SEAP的動態(tài)變化與腎小球腎炎的活動程度明顯相關，在藥物干預性治療后血清SEAP水平下降?？傊隗w內(nèi)用基因工