白念珠菌CaPTC2,CaPPH3和CaPTC5基因的鑒定和功能研究.pdf

1、蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是真核細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑中的一個關(guān)鍵調(diào)控機(jī)制,蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶分別調(diào)控底物的磷酸化狀態(tài),從而實現(xiàn)胞內(nèi)信號途徑的激活或失活。Ser／Thr蛋白磷酸酯酶是胞內(nèi)重要的一類蛋白磷酸酯酶亞家族,其中2C類蛋白磷酸酯酶是一類特異依賴于鎂離子或錳離子的單體酶。為挖掘抗真菌藥物的作用靶點,本文對白念珠菌 CaPTC2、CaPPH3和 CaPTC5基因的功能進(jìn)行了研究。
　　 利用釀酒酵母 CaPtc2p、CaPph3p和

2、CaPtc5p的氨基酸序列在白念珠菌數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索比對,我們獲得了白念珠菌 CaPTC2,CaPPH3和 CaPTC5的基因序列。CaPTC2的 ORF全長1749 bp,編碼583個氨基酸,CaPTC2與 ScPTC2所編碼蛋白的氨基酸序列相同性為31.9％。通過對 CaPtc2p的催化域進(jìn)行體外表達(dá)和蛋白磷酸酯酶活性測定,發(fā)現(xiàn)重組蛋白具有去磷酸化活性,并且這種活性依賴于 Mg2+或 Mn2+的激活,說明 CaPtc2p是一種 PP

3、2C類蛋白磷酸酯酶。我們采用 Ura—Blaster方法敲除了 CaPTC2的兩個等位基因,發(fā)現(xiàn)該基因的缺失株對SDS、唑類抗真菌藥物以及遺傳毒性試劑 HU和 MMS敏感。通過熒光定位實驗發(fā)現(xiàn)該蛋白主要定位于線粒體,同時還存在于細(xì)胞質(zhì)里。
　　 CaPPH3基因的ORF全長783 bp,編碼261個氨基酸。白念珠菌CaPPH3與釀酒酵母ScPPH3所編碼蛋白的氨基酸序列相同性為68.2％。我們利用同樣的方法構(gòu)建了pph3△／pp

4、h3△缺失株。結(jié)果發(fā)現(xiàn),該缺失株對遺傳毒性試劑 HU和MMS敏感,并且在液體菌絲誘導(dǎo)培養(yǎng)基中菌絲生成速度加快。此外,我們還發(fā)現(xiàn),CaPTC2和CaPPH3雙基因共同缺失后,雙缺失株對遺傳毒性試劑的敏感性表型呈現(xiàn)疊加的現(xiàn)象,推測他們可能通過不同的信號通路參與DNA損傷修復(fù)過程。
　　 CaPTC5基因的ORF全長1740 bp,編碼580個氨基酸。CaPtc5p與ScPtc5p的氨基酸序列相同性為39.7％。我們構(gòu)建了 ptc5△