白念珠菌新基因IPF19998的氧化還原相關(guān)功能研究.pdf

1、白念珠菌易于感染、難以防治的特點(diǎn)使其在臨床治療中表現(xiàn)為高致病性和高耐藥性。目前國(guó)際上對(duì)白念珠菌基因組的測(cè)序工作已經(jīng)完成，并可以通過(guò)公共數(shù)據(jù)庫(kù)可以獲得相應(yīng)的完整基因組序列。經(jīng)過(guò)DNA序列及編碼的氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)一個(gè)白念珠菌新基因IPF19998與釀酒酵母中的AIF1基因有高度同源性。AIF1是與人類AIF同源的酵母細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（Apoptosis inducing factor）。已經(jīng)證實(shí)在釀酒酵母中，在由H2O2或醋酸鹽誘發(fā)的凋

2、亡以及衰老過(guò)程中，Aiflp，從線粒體中轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在AIF1基因敲除菌株中，凋亡特征消失，衰老延緩[1]。由此我們推測(cè)，IPF19988是白念珠菌中的凋亡誘導(dǎo)因子，并在白念珠菌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，對(duì)該基因的進(jìn)一步研究有助于闡明白念珠菌細(xì)胞凋亡機(jī)制，為抗真菌感染藥物的研究設(shè)計(jì)提供新思路。
　　 本課題采用Ura-Blaster基因敲除策略靶向敲除和pCaEXP質(zhì)粒異位表達(dá)凋亡誘導(dǎo)因子基因IPF1999

3、8，構(gòu)建了IPF19998基因缺失菌和高表達(dá)菌。將構(gòu)建好的菌株通過(guò)比濁法測(cè)定生長(zhǎng)曲線；通過(guò)微量液基實(shí)驗(yàn)來(lái)考察IPF19998缺失菌對(duì)唑類藥物的敏感性及過(guò)氧化氫的刺激耐受性是否改變；將缺失菌在塑料培養(yǎng)板中按照生物被膜形成條件培養(yǎng)24小時(shí)并形成生物被膜，考察其生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)變化；通過(guò)熒光染料檢測(cè)IPF19998基因缺失菌在酵母態(tài)及被膜態(tài)兩種狀態(tài)下的內(nèi)源性活性氧水平（ROS），通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR考察了IPF19998基因缺失后，其他已知氧化還原相

4、關(guān)基因和生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)量的變化。結(jié)論：成功構(gòu)建白念珠菌IPF19998基因缺失菌和基因高表達(dá)菌株；IPF19998基因缺失后，菌株生長(zhǎng)速度不變；但對(duì)唑類藥物敏感性沒(méi)有明顯變化，高表達(dá)菌株對(duì)唑類藥物產(chǎn)生耐藥性；對(duì)過(guò)氧化氫刺激所引起的凋亡也與野生菌相比，無(wú)明顯差異。這與我們前期設(shè)想的結(jié)論不同。但用熒光染料測(cè)其內(nèi)源性活性氧水平（ROS），與酵母態(tài)下生成的ROS含量相比，被膜態(tài)下的菌株，不論是敲除菌株，高表達(dá)菌株還是野生型菌株，其RO

5、S產(chǎn)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于酵母態(tài)下的ROS產(chǎn)生。而在被膜態(tài)下，IPF19998基因缺失菌ROS產(chǎn)生增多，而高表達(dá)菌ROS產(chǎn)生保持一個(gè)穩(wěn)定且低的水平。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)，IPF19998基因缺失以后，其形成生物被膜的能力下降，高表達(dá)菌株生成生物被膜的能力明顯增強(qiáng)。這一結(jié)果在Real-time實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí)。IPF19998基因能改變已知氧化還原相關(guān)基因和生物被膜形成相關(guān)基因表達(dá)量的變化。根據(jù)本研究推測(cè)，IPF19998基因可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化能力，清除細(xì)胞