蝰蛇（緬甸亞種）毒纖溶酶FⅡaa的分離及生物活性研究.pdf

1、蝰蛇是世界上的主要毒蛇之一，蝰蛇(緬甸亞種)屬于蝰科蝰亞科，主要分布于東南亞的十幾個國家和地區(qū)，其毒性強(qiáng)。蝰蛇毒中含有豐富的血液毒素，至今已從其中分離出多種凝血毒素，如凝血因子Ⅹ激活劑(RVV-Ⅹ)、凝血因子Ⅴ激活劑(RVV-Ⅴ)，而對其抗凝血毒素研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)從蝰蛇(緬甸亞種)毒中分離出一種具有纖維蛋白溶解活性的蛋白組分FⅡaa，并進(jìn)一步探討了FⅡaa的生物活性特點(diǎn)。 方法和結(jié)果 1、蛇毒纖溶酶FⅡaa的分離純化

2、 蛇毒纖溶酶FⅡaa經(jīng)過三步分離程序得到。粗毒經(jīng)過CM-SephadexC-50陽離子交換層析得到11個蛋白峰，用纖維蛋白平板法檢測其活性，其中第2(FⅡ)和6峰(FⅥ)具有較高的纖溶活性。FⅡ進(jìn)一步經(jīng)SuperdexTM75凝膠層析得到三個蛋白峰，其中主峰即FⅡa具有纖溶活性，將其再經(jīng)過DEAE-SephadexA-50陰離子交換層析得到三個蛋白峰，其中第1峰(FⅡaa)具有較強(qiáng)的纖溶活性。 FⅡaa經(jīng)SDS-PAGE

3、電泳顯示為單一條帶，分子量為69000。 2、溫度和酸堿度對FⅡaa的影響 2.1FⅡaa作用最適溫度和最適pH值的測定 以Azocasein為反應(yīng)底物觀察FⅡaa在不同的溫度和pH值條件下蛋白水解活性，在30-50℃范圍內(nèi)，活性隨著溫度的升高而升高，50℃時FⅡaa的活性達(dá)到最大值，溫度超過50℃后，活性迅速下降。不同pH值條件下水解Azocasein活性不一。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，pH在8.0到10.0這個范圍內(nèi)，F(xiàn)

4、Ⅱaa的活性水平較高pH10.0時達(dá)到最大值。在極端的pH條件下(3.0-5.0，12.0)FⅡaa的活性被抑制。 2.2熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性 FⅡaa在經(jīng)過30-60℃的溫度處理15分鐘后，相對活性仍然維持在95％以上，當(dāng)溫度超過60℃時，F(xiàn)Ⅱaa相對活性迅速下降，70℃時，F(xiàn)Ⅱaa相對活性為53％，溫度達(dá)到80℃時，F(xiàn)Ⅱaa相對活性為5％，說明經(jīng)過高溫處理后FⅡaa已經(jīng)完全失活。 FⅡaa在不同的pH緩沖液處

5、理后，相對活性最高的是pH9.0組，達(dá)到107％，從pH8.0-11.0，相對活性維持在100％以上的水平。此結(jié)果與FⅡaa的最適pH結(jié)果相似，這兩個實(shí)驗(yàn)提示FⅡaa在堿性的環(huán)境下活性較高且穩(wěn)定性好。3、FⅡaa的纖維蛋白(原)溶解作用 3.1FⅡaa降解纖維蛋白原(Fibrinogen，F(xiàn)g)的作用 纖維蛋白原和不同濃度的FⅡaa37℃保溫后，不同時間點(diǎn)取樣做SDS-PAGE，以纖溶酶作陽性對照。結(jié)果表明FⅡaa對纖維

6、蛋白原的Aα鏈、Bβ鏈和γ鏈均有水解作用，對Aα鏈最敏感，Bβ鏈其次，γ鏈則需要較高濃度且作用時間較長才能水解。Aα鏈、Bβ鏈、γ鏈水解后產(chǎn)生不同分子量的片段，隨著時間的推移，這些片段也有水解。 3.2FⅡaa降解纖維蛋白(Fb)的作用 采用纖維蛋白平板法測定FⅡaa纖維蛋白溶解活性。不同濃度的FⅡaa20μl加到纖維蛋白平板表面，以尿激酶和生理鹽水分別作陽性和陰性對照。結(jié)果顯示FⅡaa可溶解纖維蛋白且有量效關(guān)系，每毫克

7、FⅡaa相當(dāng)于54.25U的尿激酶纖溶活力。FⅡaa(1mg/ml)在加熱纖維蛋白平板中有溶解纖維蛋白的透明圈，而尿激酶(50U/ml)沒有。提示FⅡaa能夠直接溶解纖維蛋白。 纖維蛋白和FⅡaa37℃保溫后，不同時間點(diǎn)取樣作SDS-PAGE分析，以纖溶酶作陽性對照。結(jié)果顯示，F(xiàn)Ⅱaa對纖維蛋白的α鏈、β鏈和γ-γ二聚體均有水解作用，對α鏈最敏感，β鏈其次，而對γ-γ二聚體的水解作用較弱。其產(chǎn)生的水解片段和纖溶酶不同。

8、4、蛋白酶抑制劑及金屬螯合劑對FⅡaa蛋白酶活性的影響 FⅡaa與不同的蛋白酶抑制劑PMSF、DTT、抑肽酶及金屬螯合劑EDTA37℃溫浴30min后測定其水解Azocasein的相對活性。結(jié)果顯示，金屬螯合劑EDTA和巰基還原劑DTT可以抑制FⅡaa的蛋白水解活性。而絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF及其它蛋白酶抑制劑抑肽酶對FⅡaa的蛋白水解活性沒有抑制作用。 5、出血活性測定 蛇毒纖溶酶FⅡaa(0.025、0.0

9、5、0.075、0.1、0.125mg/ml)0.1ml皮下注射，6小時后取皮并測量皮內(nèi)側(cè)面出血點(diǎn)直徑分別為7.7±1.0、9.9±1.4、10.5±1.8、12.7±1.4、13.5±1.3mm。最小出血劑量(MHD)為6μg。粗毒(0.1mg/ml)引起的出血點(diǎn)直徑為10.3±2.4mm，相當(dāng)于FⅡaa0.065mg/ml。 結(jié)論 1.蝰蛇(緬甸亞種)粗毒經(jīng)過CM-Sephadex-C-50陽離子交換層析、Super