原癌性轉錄因子CREB通過調控miRNA的表達影響膠質瘤細胞的生長和遷移.pdf

1、神經(jīng)膠質瘤（glioma，以下簡稱膠質瘤）是最常見，也是致死率最高的腦部腫瘤，目前尚無有效的藥物治療方法。研究膠質瘤發(fā)病的分子機制，將有助于我們找到有價值的分子靶點，從而為腫瘤的靶向治療提供思路和實驗依據(jù)。近年來，人們對于在膠質瘤中表達發(fā)生改變的miRNA進行了大規(guī)模的芯片篩查，并對其中一些差異表達的miRNA進行了功能分析，而這些原癌性或抑癌性的miRNA表達失調的原因有待發(fā)掘。找出這些miRNA表達改變的原因將有助于更全面的理解膠質

2、瘤發(fā)病原因，從而找到關鍵的藥物靶點或更有效的治療思路。作為在多種腫瘤中高表達并發(fā)揮重要作用的轉錄因子，CREB(cAMP response element-binding protein)被認為是一個重要的原癌基因，參與到腫瘤細胞的增殖、存活及轉移等各個方面的調節(jié)。然而CREB在膠質瘤中的表達及功能卻有待研究。
　　 首先，我們證明了CREB在膠質瘤中高表達并促進膠質瘤細胞的生長和存活。我們在兩例正常腦組織和十五例神經(jīng)膠質瘤組織

3、以及四株膠質瘤細胞系(U87MG、T98G、A172和U251)中檢測了CREB的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)CREB在膠質瘤組織和細胞系呈現(xiàn)高表達。利用定量PCR檢測CREB在三例膠質瘤組織和四株膠質瘤細胞系中的基因拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)在一例IV級膠質瘤組織和四例膠質瘤細胞系中CREB基因出現(xiàn)擴增現(xiàn)象。在三株膠質瘤細胞系（U87MG、T98G和U251）中利用siRNA敲低CREB后，腫瘤細胞的生長、存活及克隆生長明顯受到抑制，并且敲低CREB可以明顯抑制

4、T98G和U251細胞在軟瓊脂中的克隆生長能力。同時，用腺病毒導入的shcreb敲低CREB能顯著抑制U87MG和U251細胞在裸鼠皮下的成瘤能力。有意思的是，用腺病毒導入的shcreb敲低CREB可以明顯抑制T98G和U251的生長或存活而對人宮頸癌細胞系HeLa和正常人膠質細胞系HEB無明顯影響。
　　 其次，我們證明了CREB可以廣泛調控膠質瘤細胞中miRNA的表達，并可以直接調控mir-9和mir-23a的表達。在膠質瘤

5、細胞系T98G中敲低CREB會引起廣泛的miRNA水平的下調，而ChIP-chip和ChIP-QPCR以及報告基因實驗證實CREB直接調控了mir-9及mir-23a的轉錄。
　　 接下來，我們證明mir-23a和mir-9分別促進膠質瘤細胞的生長和遷移，并對它們的靶基因做了初步探討。我們發(fā)現(xiàn)在三株膠質瘤細胞系中敲低mir-23a可以抑制腫瘤細胞的生長和存活。而在T98G和U251細胞中敲低CREB的同時過表達mir-23a可以

6、部分回復膠質瘤細胞的生長、存活能力。通過生物信息學預測我們發(fā)現(xiàn)三個關鍵的抑癌基因（FoXO3a、FoXO4及PTEN）是潛在的mir-23a的靶基因，而熒光素酶報告基因的實驗結果證實了這三個基因的3'UTR可以被mir-23a所調控。通過三個抑癌基因在膠質瘤細胞中的蛋白表達水平以及過表達或敲低mir-23a對其蛋白水平的影響，我們認為FoXO3a及PTEN的蛋白水平可能受到mir-23a的調控。敲低CREB后FoXO3a蛋白水平下調而P

7、TEN上調，提示PTEN更可能受到CREB所調控的mir-23a的調節(jié)。在三株膠質瘤細胞系（U87MG、T98G和U251）中敲低mir-9能夠抑制膠質瘤細胞的遷移。我們發(fā)現(xiàn)敲低CREB可以抑制膠質瘤細胞的遷移能力。
　　 最后，我們利用熒光素酶報告基因實驗和蛋白水平的檢測證明mir-9可以在膠質瘤細胞中直接靶向CREB的3'UTR，提示mir-9和CREB可能形成一個負反饋環(huán)路。
　　 總之，我們證明CREB在膠質瘤組