干擾TPD52基因表達(dá)對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響及miRNA-34a通過靶向TPD52調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的周期變化.pdf

1、研究目的：
　?。?）探究TPD52基因在膠質(zhì)瘤組織、正常腦組織及U87細(xì)胞中的表達(dá)水平；（2）探究干擾TPD52基因表達(dá)后對膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響；（3）探究干擾TPD52基因表達(dá)后對膠質(zhì)瘤U87侵襲、遷移的影響；
　?。?）探究miRNA-34a在膠質(zhì)瘤組織及U87細(xì)胞中的表達(dá)水平；（5）探究miRNA-34a對膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用；
　?。?）探究miRNA-34a通過靶向TPD52調(diào)節(jié)膠

2、質(zhì)瘤U87細(xì)胞的周期變化。研究方法：
　?。?）收集我院12例膠質(zhì)瘤患者病例標(biāo)本，12例腦外傷患者正常腦組織病理標(biāo)本，應(yīng)用熒光定量PCR檢測TPD52 mRNA的表達(dá)量，應(yīng)用Western blot檢測TPD52蛋白的表達(dá)量。應(yīng)用熒光定量PCR檢測miRNA-34a的表達(dá)量。
　　（2）將攜帶著shRNA-tpd52（抑制tpd52的核苷酸序列）、shRNA-NC（陰性對照的核苷酸序列）的慢病毒體外轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87。在

3、轉(zhuǎn)染48 h后熒光顯微鏡下觀察表達(dá)GFP細(xì)胞數(shù)量，采用熒光定量PCR、Western blot分別檢測TPD52 mRNA及蛋白表達(dá)量，MTT檢測細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，AnnexinV和PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力。
　　（3）將miRNA34a模擬物及miRNA-34a抑制物轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)87細(xì)胞，并用熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)然后細(xì)胞 miRNA-34

4、a的表達(dá)水平。查閱相關(guān)文獻(xiàn)并使用生物信息網(wǎng)分析預(yù)測TPD52的3，UTR是miRNA-34a的作用靶點(diǎn)，采用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)TPD52是否為miRNA-34a的靶基因。U87細(xì)胞經(jīng)不同因素處理后，采用熒光定量PCR檢測TPD52及相關(guān)蛋白的mRNA表達(dá)水平；采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測TPD52及相關(guān)蛋白的蛋白表達(dá)水平；利用流式細(xì)胞儀檢測U87細(xì)胞的細(xì)胞周期。
　　研究結(jié)果：
　?。?）熒光定量 PCR檢測結(jié)果顯

5、示 tpd52mRNA在Ⅲ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織（ΔCT0.73±0.47）、U87細(xì)胞（ΔCT0.74±0.32）中的表達(dá)水平明顯高于正常腦組織（ΔCT1.92±0.42）(P<0.05)；而U87細(xì)胞與Ⅲ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中tpd52mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot檢測結(jié)果顯示TPD52蛋白表達(dá)量在在Ⅲ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織、U87細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于正常腦組織的表達(dá)水平。（2）U87細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染率通過攜帶的GFP

6、表達(dá)來評估，通過在熒光顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)得出細(xì)胞轉(zhuǎn)染率>90%。與 shRNA-NC組及空白對照組相比較，shRNA-tpd52組細(xì)胞TPD52 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.01)，而且細(xì)胞增殖能力明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期、細(xì)胞凋亡比例明顯增加（P<0.05），細(xì)胞遷移能力明顯下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；細(xì)胞侵襲能力明顯下降差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　?。?/p>

7、3）熒光定量 PCR檢測結(jié)果顯示 miRNA-34a在Ⅲ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織（ΔCT3.26±0.24）、U87細(xì)胞（ΔCT3.45±0.12）中的表達(dá)水平明顯低于正常腦組織（ΔCT1.94±0.40）(P<0.05)；而U87細(xì)胞與Ⅲ-Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織中miRNA-34a表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　?。?）經(jīng)轉(zhuǎn)染后的U87細(xì)胞，經(jīng)周期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA-34a模擬物可明顯使U87細(xì)胞停留在S期的細(xì)胞數(shù)量比例明顯減少為16.12%

8、，P<0.05，而轉(zhuǎn)染miRNA-34a抑制物可明顯使 U87細(xì)胞停留在 S期的細(xì)胞數(shù)量比例明顯增加為43.56%, P<0.05。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 miRNA-34a模擬物可明顯使 U87細(xì)胞中TPD52的3，UTR活性明顯降低為32%，P<0.05，而轉(zhuǎn)染miRNA-34a抑制物可明顯使U87細(xì)胞中TPD52的3，UTR活性明顯升高為58%，P<0.05。結(jié)論：
　　（1）TPD52在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平比正常腦

9、組織中較高。
　?。?）干擾TPD52基因表達(dá)，可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡、阻滯細(xì)胞周期。
　?。?）干擾TPD52基因表達(dá)，可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移能力及侵襲能力。
　?。?）miRNA-34a在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平比正常腦組織中較低。
　?。?） miRNA-34a可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞S期細(xì)胞比例。
　　（6） miRNA-34a具有直接靶向TPD52調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的周期變