c-Myc及H-ras基因靶向RNA干擾對腺樣囊性癌生長抑制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、涎腺腺樣囊性癌(SACC)發(fā)病率居涎腺惡性腫瘤的第二位,是口腔頜面部最具侵襲性的惡性腫瘤之一.該腫瘤生長緩慢,但浸潤性生長,常侵犯周圍神經(jīng)血管,易局部復(fù)發(fā),并早期發(fā)生肺轉(zhuǎn)移.目前其治療以手術(shù)切除為主,由于腫瘤的侵襲性生長方式,很難一次性完整摘除,同時(shí)該腫瘤對放療、化療均不敏感,所以預(yù)后很差,對于復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的病例治療比較棘手,尋找有效的治療方法一直是口腔醫(yī)學(xué)工作者關(guān)注的焦點(diǎn).隨著涎腺腺樣囊性癌相關(guān)基因及分子生物學(xué)研究的發(fā)展,腺樣囊性癌基因

2、治療的相關(guān)研究也在不斷深入。 RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)于1995年,1998年引起人們的關(guān)注.RNAi是由雙鏈RNA介導(dǎo)的、在轉(zhuǎn)錄后水平沉默相應(yīng)基因表達(dá)的新基因阻斷技術(shù),近幾年已成為基因治療研究的熱點(diǎn).其原理是利用小片段RNA(siRNA)堿基互補(bǔ)的原理,特異性地結(jié)合癌基因的mRNA,干擾其轉(zhuǎn)錄和翻譯,阻抑癌蛋白的合成,使癌細(xì)胞向成熟方向分化或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。 原癌基因c-Myc是my

3、c基因家族的重要成員,其產(chǎn)物屬核蛋白類的磷酸化蛋白質(zhì),在正常細(xì)胞的增殖分化過程中起重要作用.大量研究表明c-Myc基因過度表達(dá)與多種頭頸部腫瘤的發(fā)生密切相關(guān),且在腫瘤血管生成過程中起重要作用。 ras基因是一種促癌生長基因,在細(xì)胞內(nèi)信號傳遞和細(xì)胞增殖過程中起關(guān)鍵和核心作用.ras基因產(chǎn)物p21蛋白是細(xì)胞信號傳遞的樞紐,它的激活可導(dǎo)致細(xì)胞無限制增殖和永生化,致使腫瘤發(fā)生.ras基因包括H-ras、K-ras和N-ras.有研究發(fā)現(xiàn)

4、,H-ras基因mRNA在正常腮腺組織內(nèi)處于不表達(dá)或微弱表達(dá)狀態(tài),而SACC組織中H-ras呈高水平異常表達(dá),且與SACC的惡性程度、浸潤性和轉(zhuǎn)移性等密切相關(guān).抑制H-ras基因的表達(dá)將為探討SACC的組織發(fā)生、惡性程度以及對腫瘤的治療提供新的途徑。 涎腺腺樣囊性癌和其它腫瘤一樣,是一種多基因性、多步驟、多階段的發(fā)生過程,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,治療困難。是否可以利用RNAi技術(shù)沉默腺樣囊性癌細(xì)胞中活躍的癌基因c-Myc和/或H-ras的

5、表達(dá),以達(dá)到阻止或減緩腫瘤細(xì)胞生長的目的尚屬未知領(lǐng)域。在c-Myc癌基因受到干擾之后,其它癌基因的表達(dá)是否受到影響,這是值得探討的課題。c-Myc及H-ras基因的聯(lián)合沉默對腫瘤的治療效果也具有重要的探索價(jià)值。目前,國內(nèi)外文獻(xiàn)尚未見RNA干擾技術(shù)在腺樣囊性癌方面應(yīng)用的相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了c-Myc基因及H-ras基因靶向的pc-Myc-shRNA及pH-ras-shRNA真核重組RNA干擾質(zhì)粒,采用脂質(zhì)體包裹技術(shù)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染腺樣囊性癌A

6、CC-M細(xì)胞,通過沉默c-Myc和H-ras基因的表達(dá),采用多種方法觀察其對ACC-M體內(nèi)外細(xì)胞增殖及凋亡的影響。為觀察RNAi技術(shù)對體內(nèi)腺樣囊性癌的治療效果,本實(shí)驗(yàn)建立了腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,用RNAi質(zhì)粒進(jìn)行裸鼠移植瘤瘤內(nèi)注射治療,觀察其對腫瘤生長的抑制作用,為將來的腫瘤臨床治療提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。 本實(shí)驗(yàn)共分為三個(gè)部分: 第一部分　c-Myc及H-ras靶向shRNA質(zhì)粒的構(gòu)建及其對腺樣囊性癌細(xì)胞

7、 目的: 基因沉默效應(yīng)的研究目的:構(gòu)建c-Myc及H-ras基因靶向shRNA質(zhì)粒,通過目的基因干擾效果檢測,進(jìn)行最佳靶向位點(diǎn)的篩選鑒定。 方法: 設(shè)計(jì)合成以c-Myc及H-ras基因?yàn)榘邢蚰繕?biāo)的shRNA,將其定向克隆到真核表達(dá)載體pGenesil-1中形成重組質(zhì)粒；利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人腺樣囊性癌肺高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株(ACC-M),通過RT-PCR、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、免疫熒光蛋白定量分析等方法對目的基因mRNA

8、及蛋白水平的表達(dá)變化進(jìn)行檢測,分析shRNA干擾質(zhì)粒對腺樣囊性癌細(xì)胞目的基因的沉默效應(yīng),進(jìn)行最佳靶向位點(diǎn)的篩選。 結(jié)果:c-Myc基因靶向的pc-Myc1、pc-Myc2、pc-Myc3及H-ras基因靶向的pH-ras1、pH-ras2、pH-ras3以及陰性對照pHK真核重組質(zhì)粒均符合設(shè)計(jì)要求；細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,除pH-ras2轉(zhuǎn)染后細(xì)胞大量懸浮死亡外,pc-Myc1、pc-Myc2、pc-Myc3、pH-ras1、pH-ra

9、s3及pHK各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率分別為62.86％、64.57％、61.18％、60.49％、63.56％及58.03％,各組間轉(zhuǎn)染效率無顯著性差異(P>0.05).瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pc-Myc1、pc-Myc2、pc-Myc3及pHK質(zhì)粒對c-Myc mRNA水平表達(dá)抑制率分別為41.18％、60.00％、68.24％及0.00％,其中pc-Myc3質(zhì)粒的抑制效率最高；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pH-ras1、pH-ras3及pHK質(zhì)粒對H-ras mRNA水平表

10、達(dá)抑制率分別為85.24％、75.41％及6.56％,其中pH-ras1質(zhì)粒的抑制效率最高.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pc-Myc1、pc-Myc2、pc-Myc3及pHK質(zhì)粒對c-Myc蛋白表達(dá)抑制率分別為48.3％、42.61％、57.95％及0.00％,流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果與免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果相一致；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pH-ras1、pH-ras3及pHK質(zhì)粒對H-ras蛋白水平表達(dá)抑制率分別為55.21％、42.92％及2.45％,與流式細(xì)胞術(shù)檢測H-ra

11、s蛋白表達(dá)變化結(jié)果相一致。 結(jié)論:成功構(gòu)建了靶向c-Myc及H-ras癌基因的shRNA干擾質(zhì)粒；shRNA質(zhì)粒可成功轉(zhuǎn)染ACC-M細(xì)胞,各組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率達(dá)60％,各組間無顯著性差異；shRNA質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾效應(yīng)與靶位點(diǎn)高度相關(guān),具有序列特異性,pHK質(zhì)粒對H-ras及c-Myc基因無沉默效應(yīng)； c-Myc基因?yàn)榘邢驑?gòu)建的pc-Myc三組質(zhì)粒均可下調(diào)ACC-M細(xì)胞中c-Myc基因的表達(dá),其中pc-Myc3質(zhì)粒的沉默效應(yīng)最強(qiáng)

12、；H-ras基因?yàn)榘邢驑?gòu)建的pH-ras三組質(zhì)粒中,pH-ras1質(zhì)粒對ACC-M細(xì)胞中H-ras基因的沉默效應(yīng)最強(qiáng)。 第二部分c-Mye基因沉默對腺樣囊性癌細(xì)胞增殖及VEGF表達(dá)影響的研究 目的:建立穩(wěn)定表達(dá)pc-Myc質(zhì)粒的ACC-M細(xì)胞株,通過不同作用途徑探討c-Myc基因?yàn)榘邢虻膒c-Myc質(zhì)粒在體外體內(nèi)多階段對腺樣囊性癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響以及對VEGF表達(dá)的調(diào)控。 方法:通過G418篩選、綠色熒光

13、蛋白監(jiān)測及目的基因mRNA水平表達(dá)檢測鑒定,建立穩(wěn)定表達(dá)pc-Myc及pHK質(zhì)粒的細(xì)胞株；流式細(xì)胞術(shù)測定pc-Myc質(zhì)粒對腫瘤細(xì)胞生長周期的影響；MTT法檢測各組腫瘤細(xì)胞的增殖活性；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成率；裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測pc-Myc在體內(nèi)對ACC-M細(xì)胞增殖活性的影響,免疫組織化學(xué)SP法檢測移植瘤組織c-Myc、VEGF蛋白水平的表達(dá)變化及CD34染色檢測微血管密度。 結(jié)果:成功建立穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞株；pc

14、-Myc質(zhì)粒能有效降低ACC-M細(xì)胞中c-Myc基因表達(dá),抑制率為79.41％；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞G0/G1期比例明顯增加至73.40％,顯著高于陰性對照組的33.30％及空白對照組的38.80％；MTT 及平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果示ACC-pc-Myc細(xì)胞增殖活性明顯受抑；c-Myc沉默細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)成瘤能力降低,pc-Myc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組成瘤率及腫瘤體積顯著低于對照組；實(shí)驗(yàn)組移植瘤內(nèi)c-Myc蛋白表達(dá)量明顯減少的同時(shí),VEGF的表達(dá)及微

15、血管密度也降低。 結(jié)論:建立了穩(wěn)定表達(dá)pc-Myc干擾質(zhì)粒的細(xì)胞系；pc-Myc干擾質(zhì)?？梢种艫CC-M體外增殖活性,將更多細(xì)胞阻滯于G0/G1期；建立了腺樣囊性癌ACC-M細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型；pc-Myc質(zhì)粒能有效抑制ACC-M細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖活性；pc-Myc干擾質(zhì)粒明顯降低裸鼠腫瘤組織內(nèi)c-Myc蛋白表達(dá)的同時(shí),能有效降低VEGF的表達(dá)及組織內(nèi)微血管密度。 第三部分H-ras基因沉默對腺樣囊性癌細(xì)胞增殖活性

16、及細(xì)胞凋亡影響的研究 方法:通過G418篩選、綠色熒光蛋白監(jiān)測及目的基因mRNA水平表達(dá)檢測鑒定,建立穩(wěn)定表達(dá)pH-ras質(zhì)粒的細(xì)胞株；繪制細(xì)胞生長曲線,平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞克隆形成率；TUNEL及流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行各組細(xì)胞凋亡分析；裸鼠皮下移植瘤實(shí)驗(yàn)檢測H-ras沉默對細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響；移植瘤原代培養(yǎng)觀察熒光表達(dá)及細(xì)胞生物學(xué)特征；免疫組織化學(xué)法檢測H-ras蛋白的表達(dá)變化；流式細(xì)胞術(shù)及石蠟切片TUNEL測定移植瘤組織細(xì)胞

17、凋亡率。 結(jié)果:成功建立了穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞株；pH-ras質(zhì)粒能有效降低ACC-M細(xì)胞中H-ras基因表達(dá),抑制率為76.39％；平板克隆結(jié)果示ACC-pH-ras細(xì)胞增殖活性明顯受抑；流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為30.82％,顯著高于陰性對照組及空白對照組的4.29％和4.16％；H-ras沉默細(xì)胞的裸鼠體內(nèi)成瘤能力降低,pH-ras質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組成瘤率及腫瘤體積顯著低于對照組；原代培養(yǎng)可見大量瘤細(xì)胞表達(dá)綠色熒光；實(shí)驗(yàn)組瘤

18、內(nèi)H-ras蛋白表達(dá)量明顯減少；實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞凋亡率為41.55％±4.25％明顯高于對照組的4.73％±1.35％(P<0.05)。 結(jié)論:建立了穩(wěn)定表達(dá)pH-ras干擾質(zhì)粒的細(xì)胞株； pH-ras干擾質(zhì)粒可持續(xù)有效抑制ACC-M細(xì)胞體外增殖活性,誘導(dǎo)更多腫瘤細(xì)胞凋亡；pH-ras質(zhì)粒能有效抑制ACC-M細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的增殖活性；pH-ras質(zhì)粒沉默H-ras基因可抑制ACC-M細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的增殖,并有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡