血清microRNA作為食管鱗狀細胞癌診斷及手術療效評價指標的研究.pdf

1、食管癌(esophageal cancer，EC)是一種發(fā)病率占全球癌癥第八位、致死率占第六位的消化道惡性腫瘤，其男性發(fā)病率高于女性。EC主要分為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamouscell carcinoma，ESCC)、食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)和未分化癌，我國是ESCC發(fā)病率最高的國家之一。食管癌的早期癥狀不明顯，確診時大多已屬中晚期。由于ESCC患者的預后影響因素復雜

2、，很難對其進行有效的預后判斷來提高患者生存率。目前，淋巴結非轉移患者術后五年的生存率為20％～30％，而轉移患者術后五年的生存率僅為13％，因此尋找有效的ESCC診斷、手術療效評估和預后標志物迫在屑睫。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長約19～24個核苷酸的非編碼內源性單鏈小分子RNA，通過堿基互補配對的方式與靶mRNA序列的3'端非翻譯區(qū)(3’-untranslated region，3’-UTR)完全或部分結合，從

3、而抑制靶基因的表達或促使其降解。一些miRNA在腫瘤組織和正常組織中的表達水平差異顯著，具有腫瘤組織特異性。在對前列腺癌、結腸癌、胰腺癌和食管癌等癌癥的早期研究中發(fā)現，患者血清中miRNA表達譜呈現出特異性變化，提示血清miRNA可作為一種潛在的新型標志物用于腫瘤的早期診斷或預后評估。因此，我們推測ESCC患者血清中存在的特異miRNA，有望成為ESCC患者診斷、手術療效或預后評估的有效標志物。
　　目的:篩選ESCC患者血清中顯

4、著升高而在術后則明顯降低的血清miRNA，評價其對ESCC患者的臨床應用價值。
　　方法:收集未經任何治療的63例ESCC患者術前血清樣本和對應的術后1～2周的血清樣本，同時以其中26例患者術后兩周以后的血清樣本作為預后研究對象，以63例年齡、性別匹配的正常人血清作對照。首先運用低密度芯片技術對28例ESCC患者和28例正常人組成的兩份混合血清中768種miRNA的表達量進行測定，篩選出與正常人相比在ESCC患者血清中表達上調的血

5、清miRNA。其次，運用實時熒光定量PCR技術(quantitive real-time PCR，qRT-PCR)對部分低密度芯片初篩的miRNA及部分ESCC組織或癌細胞中表達異常的消化系統腫瘤相關miRNA在復篩組（18例ESCC患者術前術后血清和18例正常血清）中逐一測定，篩選出在患者血清巾顯著升高的miRNA。然后運用qRT-PCR技術在驗證組(45例ESCC患者術前術后血清和45例正常血清)中驗證，篩選復篩組和驗證組中與預后相

6、關的miRNA，用以評估其對ESCC患者的手術療效。最后對26例患者術后兩周以后進行跟蹤檢測，根據病人回訪生存情況及統計學方法評價其在預測患者生存狀況方面的價值。
　　結果:低密度芯片結果顯示，ESCC患者血清miRNA表達譜與正常人具有顯著差異，其中21種miRNA在患者血清中的表達明顯上調（2倍以上），從中選取4種miRNA(Ct＜25)及ESCC組織或癌細胞中表達異常的消化系統腫瘤相關的7種miRNA（包括miRNA-7、2

7、5、31、100、141、1247、193a-3p、194、223、337-5p及483-5p）用qRT-PCR技術在復篩組中驗證，發(fā)現其中9種miRNA(miR-25、31、100、193a-3p、223、194、141、337-5p和miR-483-53p)在患者術前血清中的表達量較正常人顯著上升（變化倍數為1.57～6.42倍，P＜0.05）;驗證組中9種miRNA在ESCC患者術前血清中依然顯著升高(變化倍數為1.47～8.09

8、倍，P＜0.05)。其中有5種miRNA（miR-141、193a-3p、194、223及337-5p）在患者術后較術前顯著降低。9種術前較正常對照顯著升高的miRNA的ROC曲線下面積分別為miR-25(AUC=0.845,95％CI=0.775～0.914), miR-31(AUC=0.748,95％CI=0.663～0.833),miR-100(AUC=0.785,95％CI=0.705～0.866), miR-141(AUC=0

9、.716,95％CI=0.626～0.806),miR-193a-3p(AUC=0.861,95％CI=0.796～0.927),miR-194(AUC=0.827,95％CI=0.755～0.899),miR-223(AUC=0.778,95％CI=0.699～0.857),miR-337-5p(AUC=0.878,95％CI=0.812～0.943), miR-483-5p(AUC=0.84,95％CI=0.79～0.89)。9種m

10、iRNA的AUC明顯高于CEA(AUC=0.578，95％CI=0.473～0.682)。根據選定的cut off值，9種血清miRNA對ESCC診斷的靈敏性和特異性分別是:miR-25為71％和86％，miR-31為62％和81％，miR-100為68％和81％，miR-141為50％和86％，miR-193a-3p為75％和89％，miR-194為62％和90％，miR-223為65％和79％，miR-337-5p為78％和91％，

11、miR-483-5p為75％和82％。在對其中26例患者術后兩周以后樣本的研究結果中發(fā)現，miR-141、194在死亡患者術后1～2周血清中明顯降低，但在術后兩周以后樣本中均有升高的趨勢;miR-223的含量變化與患者病情及生存狀況呈顯著相關。單因素相關性分析顯示，miR-141、337-5p與ESCC病理分型呈顯著正相關，miR-141、223、100與ESCC的TNM分級呈顯著正相關，因此，這幾種miRNA可能在ESCC的發(fā)生、發(fā)展

12、過程中起重要作用。
　　結論:ESCC患者術前血清樣本中9種miRNA(miR-25、31、100、141、193a-3p、194、223、337-5p和miR-483-5p)與正常人相比顯著升高，具潛在的ESCC早期診斷價值;其中5種miRNA（miR-141、223、337-5p、194和miR-193a-3p）在患者術后樣本中顯著降低，具評價手術效果潛能;而miR-194、141在死亡ESCC患者術后1～2周時降低，而在術后