HMGA2在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義.pdf

1、食管癌在我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)都是發(fā)病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，其病理組織學(xué)分類多樣，例如鱗狀細(xì)胞癌、腺癌、未分化癌等，但以下面兩種最為多見:食管腺癌、食管鱗狀細(xì)胞癌。食管癌在我國(guó)本身就高發(fā)，再加上我國(guó)人口基數(shù)大，每年新發(fā)病例便多，約占全世界新發(fā)病例的半數(shù)左右，而且可能由于遺傳、飲食習(xí)慣等原因病理組織學(xué)類型分布與歐美不同，其中食管鱗狀細(xì)胞癌占絕對(duì)多數(shù)，約占食管癌的90％，造成了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和社會(huì)負(fù)擔(dān)。隨著內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展，有不少食管鱗狀

2、細(xì)胞癌能夠在非常早期便被發(fā)現(xiàn)，從而通過(guò)內(nèi)鏡下食管粘膜剝離術(shù)治療，另外胸中段食管癌占據(jù)多數(shù)，分期稍晚的但是有外科手術(shù)機(jī)會(huì)的患者多以進(jìn)行食管癌根治術(shù)+胸腹兩野淋巴結(jié)清掃術(shù)為主，但內(nèi)鏡下食管粘膜剝離術(shù)無(wú)法對(duì)淋巴結(jié)進(jìn)行清掃，而食管癌根治術(shù)+胸腹兩野淋巴結(jié)清掃術(shù)無(wú)法對(duì)可能隱匿的頸部淋巴結(jié)進(jìn)行清掃，術(shù)后容易轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，還有很多患者發(fā)現(xiàn)時(shí)便已錯(cuò)過(guò)手術(shù)機(jī)會(huì)，總體5年生存率很低。近些年來(lái)，隨著科技和社會(huì)的進(jìn)步，分子靶向治療越來(lái)越顯示出優(yōu)勢(shì)，在一些惡性腫瘤

3、的治療方面起到了很好的作用。例如應(yīng)用索拉菲尼對(duì)肝癌進(jìn)行治療和應(yīng)用易瑞沙對(duì)肺癌進(jìn)行治療，極大的改善了腫瘤患者的預(yù)后。與食管鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)的基因及其產(chǎn)物，在近些年研究的也比較多，但到目前為止，仍然沒(méi)有能得到臨床公認(rèn)并廣泛應(yīng)用的指標(biāo)。鑒于以上幾點(diǎn)原因，我們認(rèn)為繼續(xù)尋找在食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中有重要作用的因子，并研究其作用機(jī)制，可能帶來(lái)兩方面益處:一是如果能夠提示某些患者預(yù)后差的話可以制定個(gè)體化治療，例如術(shù)后聯(lián)合放療，另外如果某些基因及

4、產(chǎn)物對(duì)癌細(xì)胞的擴(kuò)散有幫助的話可以針對(duì)其研究藥物進(jìn)行精準(zhǔn)治療。
　　高遷移率族蛋白A2，簡(jiǎn)稱HMGA2，是一種非組蛋白染色體蛋白，能夠通過(guò)改變脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，DNA)的結(jié)構(gòu)來(lái)調(diào)節(jié)某些基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，作用方式是通過(guò)AT-hook結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合，因此又被稱為“構(gòu)筑轉(zhuǎn)錄因子”。研究發(fā)現(xiàn)HMGA2與機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，在胚胎早期高表達(dá)，而在正常成人分化成熟的組織中幾乎檢測(cè)不出。近年來(lái)，多項(xiàng)

5、研究發(fā)現(xiàn)在一些良惡性腫瘤中存在HMGA2的異常表達(dá)，并且HMGA2表達(dá)增高往往預(yù)示著該腫瘤容易轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)，預(yù)后差。隨之進(jìn)一步的細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)抑制HMGA2的表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的增殖速度減慢，侵襲能力減弱。以上這些研究提示HMGA2可能在腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮一定的作用。
　　食管鱗狀細(xì)胞癌做為一種常見惡性腫瘤，HMGA2的表達(dá)如何，抑制HMGA2表達(dá)后食管鱗狀細(xì)胞癌癌細(xì)胞的增殖速度及侵襲能力會(huì)有怎樣的變化，目前尚沒(méi)有系統(tǒng)的研究報(bào)道

6、。所以我們?cè)O(shè)計(jì)了此項(xiàng)研究，首先對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌及癌旁組織中HMGA2的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，方法包括Western Blot及免疫組織化學(xué)法，其次將癌組織中HMGA2檢測(cè)結(jié)果結(jié)合患者的臨床病理資料及隨訪資料進(jìn)行分析，尋找與食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后相關(guān)的因素，然后通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染及RNA干擾的方法抑制HMGA2的異常表達(dá)，將HMGA2受到抑制的細(xì)胞進(jìn)行CCK-8法細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及transwell實(shí)驗(yàn)，從而研究HMGA2對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖及

7、侵襲能力的影響，以期為食管鱗狀細(xì)胞癌的分子靶向治療提供一個(gè)可供選擇的靶點(diǎn)。
　　第一部分 食管鱗狀細(xì)胞癌組織中HMGA2的表達(dá)檢測(cè)及其與患者臨床和病理特點(diǎn)之間的相關(guān)性研究
　　目的:
　　檢測(cè)食管鱗狀細(xì)胞癌患者的癌組織中是否有HMGA2的異常表達(dá)，及HMGA2異常表達(dá)與患者臨床特點(diǎn)和病理特點(diǎn)之間的相關(guān)性。
　　方法:
　　在這部分實(shí)驗(yàn)中，我們根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)對(duì)自2007年10月至2009年9月在山東省立醫(yī)院胸外

8、科住院并接受經(jīng)右胸上腹二切口食管癌切除+胃食管右胸頂吻合術(shù)(Ivor-Lewis)的胸中段食管鱗狀細(xì)胞癌患者進(jìn)行篩選，最終有127例患者達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)成為研究對(duì)象，對(duì)以上患者的術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行收集，每位患者留取的標(biāo)本均包括食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)組織及相應(yīng)的健康食管粘膜（corresponding healthy esophageal mucosa，CHEM）組織，對(duì)兩組標(biāo)本

9、進(jìn)行HMGA2表達(dá)情況檢測(cè)，方法包括蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)和免疫組織化學(xué)(IHC)方法，將檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。再通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS19.0將食管鱗狀細(xì)胞癌組織中HMGA2表達(dá)情況與患者的年齡、性別、腫瘤長(zhǎng)度、T分期、組織分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況用卡方檢驗(yàn)的方法進(jìn)行相關(guān)性分析。P＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　進(jìn)行免疫組織化學(xué)法檢測(cè)時(shí)，從顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕色顆粒認(rèn)為有HMGA2表

10、達(dá)。免疫組化評(píng)分≥4的樣本認(rèn)為有HMGA2陽(yáng)性表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果顯示HMGA2陽(yáng)性表達(dá)率在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中是63.3％(72/127)，在相應(yīng)的健康食管粘膜組織中無(wú)陽(yáng)性表達(dá)，兩組相比有顯著差異?？ǚ綑z驗(yàn)相關(guān)性分析顯示與HMGA2陽(yáng)性表達(dá)有相關(guān)性的臨床及病理特點(diǎn)包括:組織分化程度(P=0.008)，T分期（代表浸潤(rùn)深度）(P=0.007)，是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P＜0.001)、TNM分期(P=0.006);無(wú)相關(guān)性的臨床及病理特點(diǎn)包括:性別

11、(P=0.291)、年齡(P=0.857)及病變長(zhǎng)度(P=0.854)。迸一步的蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)顯示HMGA2的陽(yáng)性表達(dá)率在Ⅲ期和Ⅳ期患者癌組織中顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者癌組織。
　　結(jié)論:
　　食管鱗狀細(xì)胞癌中有HMGA2的高表達(dá)，且與HMGA2表達(dá)增高相關(guān)的臨床及病理特點(diǎn)包括:組織分化程度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及T分期（代表浸潤(rùn)深度），HMGA2可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)能力及臨床進(jìn)展相關(guān)。
　　第二部分

12、 影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)因素分析
　　目的:
　　研究影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的相關(guān)因素中是否包括HMGA2的表達(dá)。
　　方法:
　　本部分實(shí)驗(yàn)中，研究對(duì)象仍為2007年10月至2009年9月在山東省立醫(yī)院胸外科住院并接受經(jīng)右胸上腹二切口食管癌切除+胃食管右胸頂吻合術(shù)(Ivor-Lewis)的胸中段食管鱗狀細(xì)胞癌患者，通過(guò)對(duì)患者術(shù)后進(jìn)行定期的隨訪觀察，記錄生存時(shí)間。統(tǒng)計(jì)軟件采用SPSS19.0，統(tǒng)計(jì)方

13、法包括應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線繪制總體的生存曲線及HMGA2不同表達(dá)組的生存曲線，將收集的臨床資料、病理特點(diǎn)以及HMGA2表達(dá)情況均進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)篩選出與生存時(shí)間相關(guān)的因素，再通過(guò)Cox回歸分析最終篩選出影響患者生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。P值＜0.05時(shí)認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　結(jié)果顯示總體5年生存率是19.69％。HMGA2表達(dá)陽(yáng)性組和HMGA2表達(dá)陰性組5年生存率差異顯著(13.89％vs.

14、27.27％，P＜0.001)。通過(guò)Log-rank檢驗(yàn)得出與生存時(shí)間相關(guān)的因素還包括:TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織分化程度。將以上四項(xiàng)進(jìn)行Cox回歸多因素分析后顯示影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素包括:腫瘤TNM分期(P=0.006)，組織學(xué)分化程度(P=0.003)和HMGA2表達(dá)水平(P=0.048)。
　　結(jié)論:
　　影響食管鱗狀細(xì)胞癌患者術(shù)后5年生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素包括:腫瘤組織學(xué)分化程度、TNM分期

15、及HMGA2表達(dá)水平。
　　第三部分 應(yīng)用RNAi沉默技術(shù)觀察HMGA2基因?qū)κ彻荀[狀細(xì)胞癌Eca109細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的:
　　應(yīng)用RNAi沉默技術(shù)研究HMGA2對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109細(xì)胞增殖速度和侵襲能力的影響。
　　方法:
　　在本部分的實(shí)驗(yàn)研究中，首先對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109中HMGA2的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，方法包括定量即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)和蛋白質(zhì)免疫印

16、跡法，再通過(guò)攜帶HMGA2shRNA的慢病毒和攜帶NCshRNA的慢病毒分別轉(zhuǎn)染食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109，從而將細(xì)胞系分為三組:HMGA2組、NC組、空白對(duì)照組，分別通過(guò)定量即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)三組中HMGA2mRNA和HMGA2蛋白，驗(yàn)證HMGA2組細(xì)胞系中HMGA2的表達(dá)確實(shí)被抑制后進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)CCK-8法和transwell法來(lái)觀察抑制HMGA2表達(dá)后食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109細(xì)胞的增殖

17、速度和侵襲能力變化。
　　結(jié)果:
　　定量即時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)結(jié)果均顯示HMGA2在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系Eca109中表達(dá)增高。應(yīng)用RNA干擾技術(shù)和慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)可以成功構(gòu)建HMGA2低表達(dá)的Eca109細(xì)胞系，而且該細(xì)胞系可以穩(wěn)定傳代，與其它兩組比較，CCK-8法實(shí)驗(yàn)顯示HMGA2表達(dá)被抑制后癌細(xì)胞的增殖速度減慢，transwell實(shí)驗(yàn)顯示HMGA2表達(dá)被抑制后癌細(xì)胞的侵襲能力減弱。
　　結(jié)論: