缺血再灌注腦損傷后蛇床子素的腦保護(hù)作用研究.pdf

1、蛇床子是草本植物蛇床的干燥成熟果實(shí)，自然資源十分豐富[1]。其主要藥理活性成分是香豆素類化合物，蛇床子素（osthole，OST）即其中香豆素類化合物的主要成分[2]。近期研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有植物雌激素樣作用，且可影響部分酶的活性、蛋白的合成、鈉鉀ATP酶活性，具有潛在的神經(jīng)保護(hù)作用[3]。Homer1a蛋白可干擾Ⅰ型代謝性谷氨酸受體（metabotropicglutamatereceptorⅠ，mGluR1a）從胞漿內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到突觸后膜

2、的轉(zhuǎn)運(yùn)及其在突觸后膜的定位，并可影響細(xì)胞Ca2+通道、Shank、細(xì)胞骨架蛋白等的功能，具有神經(jīng)保護(hù)作用。本研究利用離體培養(yǎng)的大鼠皮層細(xì)胞氧糖剝奪模型（oxygenglucosedeprivation，OGD）和在體大鼠四血管阻塞法（4-vesselocclusion，4VO）腦缺血再灌注模型，研究蛇床子素后處理在缺血再灌注腦損傷后的腦保護(hù)作用及Homer1a在其中的表達(dá)情況，旨在闡明蛇床子素的神經(jīng)保護(hù)作用和該藥物保護(hù)作用的可能的分子生

3、物學(xué)機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)一：體外培養(yǎng)大鼠腦皮層神經(jīng)元氧糖剝奪后蛇床子素的神經(jīng)保護(hù)作用及其對Homer蛋白表達(dá)的影響
　　目的：造成高密度培養(yǎng)神經(jīng)元氧糖剝奪后，利用OST進(jìn)行干預(yù)，觀察其在缺血再灌注神經(jīng)元損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用。方法步驟一：建立高密度大鼠腦皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)方法；培養(yǎng)7d后，通過免疫組織化學(xué)法鑒定培養(yǎng)神經(jīng)元的純化率。步驟二：將培養(yǎng)7d的神經(jīng)元分為空白對照組（Sham組）、單純氧糖剝奪再灌注損傷組（Con組）、氧糖剝奪

4、再灌注損傷后不同劑量蛇床子素干預(yù)組（OST0.01μΜ組、OST0.1μΜ組、OST1μΜ組、OST10μΜ組、OST100μΜ組）；除Sham組外，其余各組均用無糖培養(yǎng)基置換正常培養(yǎng)基，并剝奪氧氣供應(yīng)4小時(shí)，換回正常培養(yǎng)條件造成缺血再灌注損傷，然后用蛇床子素對不同劑量OST組進(jìn)行干預(yù)；24h后運(yùn)用生物化學(xué)手段檢測各組間Caspase3和Homer1a表達(dá)情況。結(jié)果：神經(jīng)元體外培養(yǎng)7d，光鏡下見細(xì)胞核大而清晰、透亮，圓形或卵圓形，胞體呈

5、多形性，胞質(zhì)透亮，神經(jīng)元突起間相互聯(lián)系，形成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。anti-β-tubulin-Ⅲ和NF200免疫組織化學(xué)染色細(xì)胞陽性率達(dá)95％。氧糖剝奪4h恢復(fù)氧糖供應(yīng)24h后，生化分析結(jié)果顯示，各OST干預(yù)組Caspase3表達(dá)均低于Con組而高于Sham組，Homer1a表達(dá)則高于Con組。結(jié)論：缺血再灌注神經(jīng)元損傷后，蛇床子素可起到一定程度的保護(hù)作用；在對抗該損傷的過程中，Homer1a表達(dá)可能發(fā)揮一定作用。
　　實(shí)驗(yàn)二：SD大鼠缺血

6、再灌注腦損傷后蛇床子素的神經(jīng)保護(hù)作用及其對Homer蛋白表達(dá)的影響
　　目的：觀察在整體動(dòng)物缺血再灌注腦損傷后OST的神經(jīng)保護(hù)作用。方法步驟一：建立改進(jìn)的胸廓上口入路大鼠四血管阻塞法（4-vesselocclusion，4VO）腦缺血再灌注模型，其具體操作過程簡述如下：將大鼠麻醉，打開胸廓上口，分離雙側(cè)鎖骨下動(dòng)脈起始段；用動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)鎖骨下動(dòng)脈起始段和雙側(cè)頸總動(dòng)脈，15min后撤除動(dòng)脈夾，恢復(fù)腦血流再灌注。步驟二：實(shí)驗(yàn)用SD大鼠

7、50只隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、單純?nèi)毖俟嘧p傷組（Con組）和缺血再灌注損傷后不同劑量OST干預(yù)組（OST5mg/kg組、OST25mg/kg組、OST125mg/kg組）；除Sham組動(dòng)物僅接受手術(shù)，不經(jīng)歷動(dòng)脈夾閉過程外，各組動(dòng)物均接受4VO處理；恢復(fù)再灌注1小時(shí)后，各劑量OST干預(yù)組動(dòng)物分別腹腔注射蛇床子素5mg/kg、25mg/kg、125mg/kg。再灌注24h后，各實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物進(jìn)行神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分，而后，每組隨機(jī)選取3只

8、動(dòng)物用于Caspase3和Homer1a蛋白半定量分析，各組剩余的動(dòng)物用于分析海馬CA1區(qū)細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：改進(jìn)的模型操作方法簡化了原模型制作的操作程序，減小了手術(shù)損傷，且缺血效果穩(wěn)定可靠。各OST組大鼠的行為學(xué)評(píng)分和組織形態(tài)學(xué)分析結(jié)果均明顯優(yōu)于Con組（P<0.01），并在25mg/kg劑量時(shí)表現(xiàn)出最大神經(jīng)保護(hù)效果；各OST組大鼠海馬組織Caspase3表達(dá)水平顯著低于Con組，Homer1a表達(dá)均高于Con組。結(jié)論：在缺血再