成纖維細胞活化蛋白FAP對小鼠胰腺癌細胞的影響及治療研究.pdf

1、目的：構(gòu)建小鼠成纖維細胞活化蛋白FAP的真核表達質(zhì)粒，通過轉(zhuǎn)染體外真核細胞系及免疫注射C57BL/6小鼠，綜合評價該真核表達質(zhì)粒在體外及體內(nèi)表達的工作效率，并驗證該重組表達載體作為核酸疫苗對于腫瘤相關(guān)成纖維細胞的殺傷效果以及對荷瘤小鼠胰腺癌腫瘤細胞增殖的抑制效應(yīng)，從而為胰腺癌的預防和治療提供一個新的手段和思路。
　　方法：根據(jù)GenBank中小鼠FAP基因(NM_007986)全序列設(shè)計PCR引物，利用多聚酶鏈式反應(yīng)獲得其開放式閱

2、讀框(ORF)。將目的基因片段克隆至真核表達載體pcDNA6/myc-His-B，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌并篩選重組子。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HEK293細胞系，利用免疫熒光染色法(IF)及蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blotting)檢測外源性FAP蛋白是否能夠在細胞中順利表達。之后，通過分離并培養(yǎng)原代小鼠胰腺癌細胞及腫瘤相關(guān)成纖維細胞，利用小干擾分子RNA(siRNA)靶向沉默其內(nèi)源性FAP蛋白的表達，利用實時熒光定量PCR(RTQ

3、-PCR)、Western Blotting實驗及免疫熒光(IF)實驗來檢測其靶向沉默的效果；同時利用噻唑藍染色法(MTT)和流式細胞術(shù)(FCM)來檢測當內(nèi)源性FAP蛋白表達下調(diào)后，“原代胰腺癌-腫瘤相關(guān)成纖維細胞”共培養(yǎng)體系中，兩種細胞的增殖和凋亡情況，明確FAP對于胰腺癌細胞及胰腺癌相關(guān)成纖維細胞增殖和生長的抑制作用。利用FAP真核表達質(zhì)粒免疫C57BL/6小鼠，通過免疫組織化學(ICH)及RTQ-PCR方法檢測其在小鼠體內(nèi)的表達情

4、況。最后，將小鼠胰腺癌細胞接種于小鼠皮下，分組：FAP免疫組、空白質(zhì)粒免疫組和生理鹽水對照組。而后監(jiān)測瘤體體積、小鼠生命周期及瘤體組織中波形蛋白Vimentin(成纖維細胞標志)、角蛋白CK8(上皮細胞標志)及FAP的表達，來衡量FAP作為核酸疫苗是否可以預防和控制胰腺癌腫瘤細胞的增殖和生長，延長荷瘤小鼠的生存周期。
　　結(jié)果：對于小鼠FAP的真核載體，經(jīng)過酶切鑒定、測序比對，確定所篩選的陽性克隆為pcDNA6-mFAP重組子，其

5、可在真核細胞HEK293中正常表達，并產(chǎn)生相應(yīng)蛋白質(zhì)產(chǎn)物。免疫熒光染色結(jié)果也表明，在轉(zhuǎn)染pcDNA6-mFAP重組子的細胞中，其表現(xiàn)出明顯的紅色熒光(anti-Myc-CY3)和綠色熒光(anti-FAP-FITC)，證實在其表面有FAP蛋白的表達；而對于空白質(zhì)粒組和無轉(zhuǎn)染組的細胞均無上述熒光表達。另外，Western Blotting結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)染pcDNA6-mFAP重組子的細胞總蛋白中，有抗FAP的條帶與抗Myc的條帶，而其他兩

6、組細胞均無此條帶產(chǎn)生，故所有實驗結(jié)果均表明，所構(gòu)建的pcDNA6-mFAP重組子可以在體外培養(yǎng)的真核細胞中順利表達外源性FAP蛋白。隨后，本實驗成功分離小鼠原代胰腺癌細胞和腫瘤相關(guān)成纖維細胞，并且建立了兩者共培養(yǎng)體系模型。HE染色可見共培養(yǎng)體系模型中的胰腺癌細胞及腫瘤成纖維細胞共同生長。RTQ-PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染了siRNA-FAP的共培養(yǎng)體系模型中，F(xiàn)AP蛋白的mRNA表達量(0.52±0.02，n=3)遠遠低于轉(zhuǎn)染siRNA-MO

7、CK的共培養(yǎng)體系模型(0.99+0.07，n=3，P<0.05，t test)及未轉(zhuǎn)染任何分子的空白對照組共培養(yǎng)體系模型(1.01±0.10，n=3，P<0.05，ttest)，該結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學差異。同樣Western Blotting實驗結(jié)果也顯示，轉(zhuǎn)染了siRNA-FAP的共培養(yǎng)體系模型中，F(xiàn)AP蛋白的表達量(27.18％±3.23％)遠遠低于轉(zhuǎn)染siRNA-MOCK的共培養(yǎng)體系模型(61.58％±4.72％，P=0.0317

8、，t test)及未轉(zhuǎn)染任何分子的空白對照組共培養(yǎng)體系模型(65.29％±4.78％，P=0.0389，ttest)，該結(jié)果具有顯著的統(tǒng)計學差異。實驗結(jié)果表明，所設(shè)計的siRNA可以成功下調(diào)細胞內(nèi)源性FAP的表達。此后MTT實驗結(jié)果顯示，siRNA-FAP轉(zhuǎn)染組胰腺癌細胞的生長速率遠遠小于空白對照組和轉(zhuǎn)染siRNA-MOCK的細胞組；而胰腺癌細胞的增殖抑制率從轉(zhuǎn)染后第二天起即明顯高于另外兩組數(shù)據(jù)，差異具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)，

9、且該增殖抑制率隨時間的增長呈現(xiàn)負增長趨勢，至第七天達峰值。另外，F(xiàn)CM結(jié)果也表明，轉(zhuǎn)染了siRNA-FAP的細胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象(42.31％±5.34％)，其與未轉(zhuǎn)染組相比(7.02％±2.11％)，具有非常顯著的統(tǒng)計學差異(P<0.01)。上述實驗結(jié)果表明，F(xiàn)AP蛋白的表達下調(diào)會顯著抑制小鼠胰腺癌細胞及腫瘤成纖維細胞的增殖和生長，并引起細胞的凋亡。最后，我們對C57BL/6小鼠進行FAP免疫，免疫熒光檢測和RTQ-PCR結(jié)果都提

10、示，注射了FAP真核表達質(zhì)粒的小鼠，其組織中均有FAP的高表達，而空白質(zhì)粒組和生理鹽水組中未見相應(yīng)蛋白表達。同時，通過對不同分組小鼠注射相應(yīng)質(zhì)粒后進行腫瘤細胞接種，進行免疫組化測定并計算其生存周期和瘤體體積測量。免疫組化結(jié)果顯示：經(jīng)FAP真核質(zhì)粒免疫后的小鼠，其腫瘤相關(guān)成纖維細胞表面FAP蛋白的表達明顯減弱，與生理鹽水對照組相比，具有顯著的統(tǒng)計學差異。同時，腫瘤上皮細胞標志CK8和成纖維細胞標志Vemetin的表達，也明顯低于生理鹽水對

11、照組，具有非常顯著的統(tǒng)計學差異。然而，注射空白質(zhì)粒免疫組的小鼠，其腫瘤上的FAP、CK8及Vemetin三個蛋白的表達與生理鹽水組相比無顯著的統(tǒng)計學差異。腫瘤體積測量結(jié)果表明，經(jīng)FAP核酸免疫過的小鼠，其成瘤的速率顯著慢于未注射FAP核酸疫苗的對照組：而且，在4周內(nèi)，F(xiàn)AP免疫組小鼠的腫瘤生長緩慢，腫瘤體積((長徑×短徑2)/2)增長不明顯，其與注射生理鹽水空白對照組相比，有顯著的統(tǒng)計學差異。對于注射生理鹽水空白對照組和空白質(zhì)粒免疫組的

12、老鼠，腫瘤生長迅速，而該兩組的腫瘤體積之比不存在統(tǒng)計學差異。生存周期結(jié)果表明，經(jīng)FAP免疫后的小鼠，生存率普遍提高，且第1、第2周均無死亡，第4周的存活數(shù)為6只。而生理鹽水對照組和空白質(zhì)粒免疫組的小鼠，至第2周開始陸續(xù)死亡，死亡的數(shù)量均大于FAP免疫組的小鼠，當?shù)降?周時，生理鹽水組和空白質(zhì)粒組的存活數(shù)分別只有3只和5只，均少于FAP免疫組。
　　結(jié)論：利用基因工程構(gòu)建的FAP真核表達質(zhì)?？梢皂樌隗w外培養(yǎng)的真核細胞中，及小鼠體內(nèi)