成年男性無精子癥的臨床資料分析及PIAS2初步功能研究.pdf

1、研究背景：
　　 夫婦婚后同居1年以上,未采用任何避孕措施而女方未受孕的(除外女方因素),稱之為男性不育。不孕不育是目前影響家庭穩(wěn)定和社會和諧的主要因為之一,這是一個世界性的醫(yī)學(xué)和社會問題,亦是危害人類生殖健康的重要疾病之一.近年來,根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計,不育夫婦占已婚育齡夫婦的7％～15％.其中男1牛不育又占不育夫婦總數(shù)的43％。近來的研究更顯示,在不孕不育的夫婦中,由于男性因素導(dǎo)致的不育提高到了2/3。
　　 男性

2、不育是一個復(fù)雜的臨床綜合癥,在生育異常中占40～50％,是由于多種疾病或多因素造成的結(jié)果,其中無精子癥是男性不育的常見因為之一。引起無精子癥的病因比較復(fù)雜,其中包括染色體的異常以及性激素的改變等。無精子癥的病因概括起來分為兩大類型,一是睪丸本身的生精功能障礙如遺傳學(xué)異常和內(nèi)分泌紊亂導(dǎo)致的睪丸生精功能障礙,從而使精子不能生成造成男性不育,稱為原發(fā)性無精子癥或非梗阻性無精子癥；二是睪丸的生精功能正常,但由于輸精管道的阻塞,精子不能排出體外,

3、這類又稱為梗阻性無精子癥,后者又可以根據(jù)其病理形態(tài)及生精功能的不同又可以分為不同的病理類型。按照第9版阿克曼外科病理學(xué)睪丸生殖病理的最新標(biāo)準(zhǔn)將病變分為六大類:生精功能正常或基本正常、精子發(fā)生低下、唯支持細(xì)胞綜合癥、生精細(xì)胞發(fā)育完全阻滯、生精細(xì)胞發(fā)育不完全阻滯及Klinefelter綜合癥等。對于無精子癥而言,睪丸活檢無疑是男性生殖病理研究的重要檢測手段,也是無精子癥男性臨床及病理診斷與分類、病因分析和臨床治療結(jié)局判斷的主要參考指標(biāo)。睪丸

4、活檢雖是一種有創(chuàng)性檢查,但它是診斷無精子癥的最直接的方法,對治療及臨床結(jié)局的判斷有實用價值。
　　 近年來,隨著助孕技術(shù)的迅速發(fā)展,越來越多的新技術(shù)、新方法運用于不育癥的治療中。1992年P(guān)alermo等首次成功使用卵胞漿內(nèi)單精子注射(intracytop lasmic sperm injection,ICSI)獲得妊娠,并迅速在世界范圍內(nèi)推廣,以治療男性無精子癥,使無精子癥男性能夠獲得自己的后代。該技術(shù)通過顯微授精技術(shù)將精子直

5、接注入卵母細(xì)胞的卵胞漿內(nèi)使之受精,精子來源不儀可以采用自然射出的精子外,還可用附睪或睪丸內(nèi)的精子。而且采用的方法也有多種如:顯微外科附睪精子抽吸術(shù)(microsurgical epididymal spermaspiration,MESA)、PESA、TESA、睪丸細(xì)針穿刺抽吸術(shù)(testicular fine needleaspiration,TFNA)、睪丸精子提取術(shù)(testicular sperm extraction,TESE

6、)和睪丸切開活檢等,其中PESA,TESA具有創(chuàng)傷小、費用低和效果好的優(yōu)點。近年來,應(yīng)用PESA、TESA獲取的精子行ICSI均廣泛運用于臨床并獲得成功,然而使用何種方法最好以獲取更好的治療結(jié)局以及如何使用該種方法仍需進(jìn)一步探討。同時不同病理類型即生精功能不同的無精子癥患者與ICSI妊娠率的關(guān)系也值得我們研究,以更好指導(dǎo)診斷,治療方案的選擇及治療結(jié)局的估價。
　　 睪丸活檢在無精子癥診斷中的作用是不言而喻的,但是睪丸活檢組織的病

7、理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)目前還比較混亂,沒有公認(rèn)的,統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn),而且?guī)в幸欢ǖ闹饔^性。因此發(fā)現(xiàn)與生精功能密切相關(guān),可以潛在判斷睪丸生精功能的蛋白標(biāo)志物是很有意義的。PIAS蛋白是STATs(signal transdticer and activator oftranscription,STATs)信號通路的負(fù)調(diào)控因子。PIAS蛋白家族包括PIAS1、PIAS3、PIASxα(PIAS2)、PIASx B和PIASy 5個成員。近年的研究發(fā)現(xiàn)PIA

8、S家族蛋白具有SUMO E3(small ubiquitin like modifier E3)連接酶活性,并能夠通過多種機(jī)制上調(diào)或下調(diào)60多種蛋白的活性。這60多種蛋白中絕大多數(shù)是轉(zhuǎn)錄因子,這其中就包括了已知的原癌蛋白JUN、MYB、STAT3和抑癌蛋白p53,除此之外,PIAS蛋白還能夠調(diào)節(jié)與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的NF2κB的p65亞單位、SMAD3、SMAD4等轉(zhuǎn)錄因子的活性。我們通過PIAS2在不同病理類型的無精子癥男性睪丸組織的研

9、究發(fā)現(xiàn)PIAS2與睪丸生精功能有一定關(guān)系,可能是一個潛在的判斷睪丸生精功能的指標(biāo)。
　　 研究目的：
　　 1、收集南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院泌尿外科2005年1月-2008年10月睪丸組織活檢臨床資料,對其病理論斷類型進(jìn)行分析,以探討睪丸活檢在男性無精子癥診治中的病理及臨床意義。
　　 2、通過收集2002年1月至2008年12月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院生殖中心進(jìn)行治療的無精子癥的不育夫婦180對,女方均為原發(fā)性不孕的

10、303次ICSI的臨床資料。對其病理論斷類型及ICSI后妊娠率進(jìn)行分析,以探討不同取精子方式及不同生精功能狀態(tài)與ICSI妊娠結(jié)局之間的關(guān)系。
　　 3、應(yīng)用免疫組化法(SP)對PIAS2在不同生精功能狀態(tài)的睪丸組織進(jìn)行研究以探討PIAS2在不同生精功能狀態(tài)的人睪丸組織中的表達(dá)情況。
　　 研究方法
　　 1、采用回顧性研究調(diào)查南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院泌尿外科2005年1月-2008年10月共538例睪丸組織活檢資料,

11、按照第9版阿克曼外科病理學(xué)睪丸生殖病理的最新標(biāo)準(zhǔn)將病變分為六大類:生精功能正?；蚧菊！⒕影l(fā)生低下、唯支持細(xì)胞綜合癥、生精細(xì)胞發(fā)育完全阻滯、生精細(xì)胞發(fā)育不完全阻滯及Klinefelter綜合癥等。并進(jìn)一步根據(jù)曲細(xì)精管細(xì)胞種類、數(shù)量、比例與排列方式、管徑大小、曲細(xì)精管與間質(zhì)的比例將精子發(fā)生低下組分為輕度生精功能障礙、中度生精功能障礙、重度生精功能障礙三個亞型。計算各種病理類型所占比重。計數(shù)資料以百分率表示。
　　 2、采用回顧

12、性研究調(diào)查對2002年1月至2008年12月在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院生殖中心進(jìn)行治療的180對,女方均為原發(fā)性不孕,無精子癥的不育夫婦的無精子癥病理類型及生精功能狀態(tài),附睪精子抽吸術(shù)(PESA)或皮睪丸精子抽吸術(shù)(TESA),ICSI妊娠率等臨床資料進(jìn)行分析研究。使用Spss13.0統(tǒng)計學(xué)軟件包,計數(shù)資料以百分率表示,x2檢驗。P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 3、從病理科獲得生精功能正?；蚧菊?n=40)、精子發(fā)生低下(

13、n:20)、唯支持細(xì)胞綜合癥(n=20)等80例無精子癥患者的相應(yīng)石蠟塊,制作免疫組化病理白片。選擇上述各型結(jié)構(gòu)完整的睪丸組織切片經(jīng)干燥25 h后,常規(guī)脫蠟,以PBS清洗3次,每次5 min；0.3％H2O2甲醇溶液封閉,室溫下20 min蒸餾水清洗3次,每次5 min；0.01 mol/L檸檬酸緩沖液(pH 6.0)抗原高壓熱修復(fù)2min；冷卻至室溫PBS清洗3次,每次5 min；10％正常山羊血清封閉室溫10 min；除去多余血清封

14、閉劑；加小鼠抗人PIAS2單克隆抗體37℃30min；PBS清洗3次,每次5 min生物素標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體37℃孵育15 minPBS清沈3次,每次5 min；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉菌抗生物素蛋白工作液,37℃孵育15 min；PBS沖洗3次,每次5 min；自來水充分沖洗,復(fù)染,封片。
　　 研究結(jié)果
　　 1、538例患者中,生精功能正?；蚧菊５牟G丸組織191例,占35.5％；精子發(fā)生低下185例,

15、占34.38％；唯支持細(xì)胞綜合癥97例,占18.03％；生精細(xì)胞發(fā)育完全阻滯23例,占4.28％；生精細(xì)胞發(fā)育不完全阻滯30例,占5.58％；Klinefelter綜合癥12例,占2.23％。其中精子發(fā)生低下組中:輕度生精功能障礙88例,占16.35％；中度生精功能障礙48例,占8.92％；重度生精功能障礙49例,占9.11％。
　　 2、216次ICSI采用PESA獲得附睪精子,87次ICSI采用TESA獲得睪丸精子,PESA

16、和TESA組的妊娠率分別為41.7％和43.7％,兩組妊娠率差異無顯著性(p>0.05)。隨著生精功能狀態(tài)從正常到重度的變化,其妊娠率依次為:46.8％,41.6％,36.7％和16.7％.其中生精功能正常組與輕度,中度生精功能障礙組均無顯著性差異(p>0.05),均與重度生精功能障礙組有顯著性差異(p<0.05)。
　　 3、PIAS2在各級生精細(xì)胞多為強(qiáng)陽性表達(dá),呈深棕黃色；PIAS2在間質(zhì)細(xì)胞(Leydig cell)及支

17、持細(xì)胞(Sertoli cell)表達(dá)弱陽性表達(dá)或不表達(dá)。生精功能基本正常組PIAS2表達(dá)均呈陽性表達(dá)；唯支持細(xì)胞綜合征組支持細(xì)胞呈陰性表達(dá)。生精功能低下組病例PIAS2表達(dá)較正常對照弱且少,雖然生精小管有表達(dá),但非常散在,數(shù)量非常少。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),唯支持細(xì)胞綜合癥組及精子發(fā)生低下組與生精功能正常組比較,PIAS2陽性率存在顯著差異(P<0.05)。
　　 結(jié)論
　　 1、睪丸活檢是診斷無精子癥的最直接的方法,并對治療

18、及預(yù)后判斷有實用價值；
　　 2、采用PESA或TESA獲得的精子與ICSI治療結(jié)果無相關(guān)性；
　　 3、采用PESA或TESA結(jié)合ICSI是治療男性無精子癥的有效方法；
　　 4、隨著睪丸生精功能的惡化其妊娠率逐漸降低；
　　 5、生精功能正常組與輕度,中度生精功能障礙組無顯著性差異,均與重度生精功能障礙組有顯著性差異；
　　 6、對于中度生精功能障礙男性不育患者可建議其試行ICSI；