在感染柯薩奇B-,3-病毒的乳鼠心肌細胞中IL-18對STAT-,3-，ERK，NF-κB通路的影響及相關性研究.pdf

1、【目的】①研究IL-18對感染柯薩奇B3病毒(CoxsackieB3virusCVB3)心肌細胞的保護作用；②Janus激酶信號轉導子與轉錄激活子(Januskinasessignaltransducersandactivatorsoftranscription，JAK-STAT)，細胞外信號調節(jié)激酶通路(extracellularsignal-regulationkinaseERK通路)，核轉錄因子(NF-κB)是細胞生長增殖的主要3

2、條信號轉導途徑，通過研究STAT3，ERK，NF-κB的活化蛋白P-STAT3，P-ERK，NF-κBp65在感染病毒的心肌細胞中的表達來探討病毒感染心肌細胞的主要信號轉導通路。探索核轉錄因子抑制劑吡咯基二硫氨基甲酸酯(PyrrolidineDithiocarbamate,PDTC)對病毒感染搏動心肌細胞的作用及信號轉導機制。③探討在感染柯薩奇B3病毒的乳鼠心肌細胞中IL-18對STAT3,ERK，NF-κB通路的影響及相關性。

3、 【方法】第一部分IL-18對感染柯薩奇B3病毒乳鼠心肌細胞的保護作用①心肌細胞的分離培養(yǎng)在無菌條件下取出生2天內wister大鼠心臟，剪成1-2mm碎片，置于0.1％胰酶中，37℃10分鐘消化3次，每次消化后吹打，收集消化液加等體積20％胎牛血清培養(yǎng)液終止消化，1000轉/分離心5分鐘，沉淀混勻制成細胞懸液，用血細胞計數器嚴格計數后，分裝于24孔、96孔組織培養(yǎng)板，每孔中每ml生長液接種5×105細胞。37℃，5％CO2培養(yǎng)48h，換

4、液，72h細胞搏動后用于試驗。 ②IL-18最大無毒劑量的觀察將培養(yǎng)3d的心肌細胞換液后加入不同濃度IL-18：2，4，6，8，10，20，30，40ng/ml，在培養(yǎng)的2、5d，觀察細胞形態(tài)，搏動頻率及LDH、CK。 ③不同濃度IL-18對心肌細胞的保護作用心肌細胞感染模型的建立：將柯薩奇B3M株(CVB3M)在心肌細胞上測50％組織感染率(TCID50)，選擇100TCID50作為實驗接種濃度，并加入不同濃度IL-1

5、8，觀察細胞形態(tài)及搏動變化，并在第2、5d測定細胞培養(yǎng)液中LDH與CK的含量。 1.5IL-18對感染病毒心肌細胞CPE和心肌酶譜的影響將分離培養(yǎng)3d的心肌細胞分為4組，感染組(n=10)：用CVB3感染心肌細胞；干預組(n=10)：心肌細胞感染病毒后加入IL-18(8ng/ml)；IL-18組(n=6)：正常心肌細胞加入IL-18(8ng/ml)；對照組(n=7)；正常心肌細胞。實驗實施后觀察細胞形態(tài)及搏動變化，并在第2、5d

6、測定細胞培養(yǎng)液中LDH與CK的含量。 第二部分NF-kB、ERK、STAT3在乳鼠病毒感染心肌細胞中的作用①心肌細胞的分離培養(yǎng)同前 ②心肌細胞感染模型的建立將柯薩奇B3M株(CVB3M株)，在心肌細胞上測50％組織感染率(TCID50)，選擇100TCID50作為實驗接種濃度。將感染組在培養(yǎng)的第三天加入100TCID50CVB3病毒液100μl，同時在對照組細胞中加等量的維持液，并在同等情況下于培養(yǎng)第七天用細胞變性效果法

7、(CellcytopathiceffectCPE)觀察細胞病變。 ③抑制劑PDTC干預心肌細胞將擬行PDTC干預的心肌細胞，再加100TCID50CVB3病毒液100μl孵育，在37℃，5％CO2進行培養(yǎng)，每日觀察心肌細胞病變，直到孵病毒后第七天。 ④心肌蛋白制備各組細胞用0.02％EDTA懸起，離心棄上清。將細胞沉淀用PBS沖洗2次后加入細胞裂解液，冰上孵育15分鐘，10000r/min離心10min，取上清得到蛋白。

8、用BioRad試劑盒測定蛋白濃度。 ⑤免疫印跡(Westenblot)法測定各組NF-kB65,P-ERK,P-STAT3蛋白含量。⑥MTT法檢測細胞活性分為對照組，CVB3感染組，PDTC干預組(CVB3+PDTC10μmol/l，CVB3+PDTC40μmol/l)。檢測各組細胞活性。 第三部分在感染柯薩奇B3病毒的乳鼠心肌細胞中IL-18對STAT3,ERK，NF-κB通路的影響 ①心肌細胞的分離培養(yǎng)同前②

9、心肌細胞感染模型的建立同前③IL-18干預心肌細胞將含不同濃度IL-182，4，6，8，10，20，30，40ng/ml培養(yǎng)基分別加入病毒感染的心肌細胞，每天用以上濃度的IL-18換液，持續(xù)7天。 ④心肌蛋白制備同前⑤免疫印跡(Westenblot)法測各組P-STAT3，P-ERK，NF-kBP65蛋白含量 【結果】第一部分IL-18對感染柯薩奇B3病毒乳鼠心肌細胞的保護作用①感染組感染病毒后第2、5天心肌細胞病變程度

10、較其余3組明顯，LDH和CK濃度明顯升高，與其余3組比較差異有顯著性意義(P＜0.05)。②IL-18濃度≥40ng/ml時對正常心肌細胞有毒性作用。③IL-18濃度在4～20ng/ml范圍內對感染心肌細胞具有保護作用。 第二部分NF-kB、ERK、STAT3在乳鼠病毒感染心肌細胞中的作用①感染組與對照組比較，心肌細胞活性明顯降低，CPE加重；②感染組NF-kBP6，P-ERK,P-STAT3蛋白表達明顯高于對照組(P＜0.01

11、)。③PDTC干預組心肌細胞活性明顯低于感染組，CPE較感染組輕，NF-kBP65蛋白表達明顯低于感染組(P＜0.01)。 第三部分在感染柯薩奇B3病毒的乳鼠心肌細胞中IL-18對STAT3，ERK，NF-κB通路的影響 ①MTT法顯示IL-18為40ng/ml時細胞出現病變，而8ngm/l時細胞存活率最高(P＞0.05)。 ②Westenblot示在感染柯薩奇B3病毒的乳鼠心肌細胞中IL-18對STAT3，ER

12、K，NF-κB均有抑制作用，但對ERK，STAT3的抑制作用更明顯。 【結論】①IL-18可以抑制CVB3對心肌細胞的損傷，對CVB3感染的心肌細胞有保護作用。 ②coxsackieB3病毒在感染早期可導致心肌細胞損傷，其作用機制可能為激活NF-kB,ERK，STAT3信號通路，PDTC對乳鼠病毒感染心肌細胞有保護作用。 ③ERK,STAT3信號通路在IL-18對感染柯薩奇B3病毒的乳鼠心肌細胞的保護作用中起了重