乙型肝炎病毒X基因相關(guān)肝細(xì)胞癌變的差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、肝細(xì)胞癌(HepatocellularCarcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，居我國癌癥死亡的第三位。大約有80％的HCC與乙肝病毒(HeptitisBVirus，HBV)感染有關(guān)，其致病機理比較復(fù)雜，危害嚴(yán)重。HBV基因組包含4個開放閱讀框，包括S、C、P和X區(qū)，分別編碼相應(yīng)的抗原蛋白。HBx是HBV基因組所編碼蛋白質(zhì)中唯一具有多種調(diào)控功能的病毒蛋白質(zhì)，可反式激活一些細(xì)胞的原癌基因及病毒的基因，HBx通過多種方式

2、直接或間接地對病毒自身的復(fù)制與增殖以及宿主細(xì)胞中基因的表達(dá)與調(diào)控、細(xì)胞的凋亡與癌變等過程產(chǎn)生廣泛的影響。HBx的這種現(xiàn)象與機制在近些年成為研究的熱點，逐漸闡明HBx與宿主蛋白質(zhì)廣泛地相互作用，但HBx誘發(fā)肝細(xì)胞癌的具體機制仍不完全清楚。本研究利用二維差異凝膠電泳技術(shù)(Two-dimensionalDifferentialIn-gelElectrophoresis，DIGE)，以期通過比較相關(guān)肝細(xì)胞在轉(zhuǎn)染HBx前后細(xì)胞蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異

3、，找到HBx與HCC密切相關(guān)的差異蛋白。 為了進行乙型肝炎病毒(HBV)X基因相關(guān)肝細(xì)胞癌變的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析，我們構(gòu)建了HBx相關(guān)的肝細(xì)胞模型。首先參考GenBank核苷酸序列庫中的HBV核苷酸序列設(shè)計合成了一對用于HBx基因擴增的引物，以質(zhì)粒V5為模板，擴增兩端分別包含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點的X基因序列。然后將EGFP載體及X基因的PCR產(chǎn)物雙酶切后用T4連接酶將兩者連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09，所構(gòu)建的重組質(zhì)粒命

4、名為EGFP-HBx。將重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞Changliver及HepG2，激光共聚焦顯微鏡下檢測其轉(zhuǎn)染效率，并挑選已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進行單克隆培養(yǎng)，在G418的作用下篩選穩(wěn)定株細(xì)胞，使用RT-PCR和WesternBlotting檢測HBx的表達(dá)情況，進一步用流式細(xì)胞術(shù)分析HBx轉(zhuǎn)染進細(xì)胞Changliver后細(xì)胞周期發(fā)生的變化。雙酶切結(jié)果和序列分析表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。激光共聚焦顯微鏡下觀察到HBx轉(zhuǎn)染到HepG2的效率要比Cha

5、ngliver高，RT-PCR和WesternBlotting結(jié)果都能證實HBx在細(xì)胞Changliver及HepG2已表達(dá)，而且流式細(xì)胞術(shù)分析表明HBx蛋白加快了細(xì)胞周期進程，進一步證實HBx能促進細(xì)胞的增殖。 利用二維差異凝膠電泳技術(shù)DIGE技術(shù)研究肝癌細(xì)胞與正常細(xì)胞的差異時應(yīng)先對其蛋白樣品進行標(biāo)記系統(tǒng)評估，以確保正式實驗的成功。我們對提取樣品進行了2DE的重復(fù)性實驗，結(jié)果顯示其重復(fù)性都能達(dá)到90％以上。然后將提取的細(xì)胞蛋白

6、經(jīng)DIGETM試劑盒的3重?zé)晒?Cy2、Cy3、Cy5)標(biāo)記后再進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和雙向電泳(2DE，Two-dimensionalElectrophoresis)。SDS-PAGE掃描后的圖像使用ImageQuant軟件進行分析，結(jié)果說明肝癌細(xì)胞蛋白提取液與該染料能相互兼容，樣品得到了有效的標(biāo)記，且蛋白量與熒光強度之間有較好的線性關(guān)系。2DE的掃描圖像使用DeCyder5.0軟件的DIA(Differentia

7、lIn-gelAnalysis)和BVA(BiologicalVariationAnalysis)模式分析，結(jié)果說明Cy3和Cy5標(biāo)記的蛋白質(zhì)定量結(jié)果基本一致，但該染料標(biāo)記肝癌細(xì)胞蛋白后會造成極少量蛋白如低分子量蛋白和極酸性極堿性蛋白出現(xiàn)位置偏差，給蛋白定量帶來一定的誤差，而BVA中的反標(biāo)策略能夠有效糾正這種由于不同熒光標(biāo)記帶來的定量誤差。總之，我們對整個DIGE實驗流程都進行了系統(tǒng)評價，標(biāo)記實驗和標(biāo)記評價都獲得了較好的結(jié)果，達(dá)到了滿意

8、的定量效果，提示該蛋白完全可以進行正式2D-DIGE實驗。我們首次報道了用同一肝癌樣品進行不同熒光標(biāo)記后進行2DE的評估方法，該方法支持了DIGE體系定量的可靠性，而且能給出定量的誤差范圍，更進一步地完善了DIGE技術(shù)的評估體系，為DIGE技術(shù)平臺的質(zhì)量控制提供了很好的參考。 在肝癌細(xì)胞蛋白樣品的2D-DIGE技術(shù)體系成熟之后，我們利用該技術(shù)結(jié)合生物質(zhì)譜MALDI-TOF-TOF/MSMS比較了HBx基因在轉(zhuǎn)染相應(yīng)肝細(xì)胞系Cha

9、ngliver和HepG2細(xì)胞前后的差異，及HBV整合進細(xì)胞HepG2后的變化，并對部份蛋白進行了鑒定，以期探索HBX造成細(xì)胞癌變的機理。在p＜0.05、|ration|＞2時我們在以上三個比較組里分別找到了25、30、159個差異蛋白。統(tǒng)計分析后可以提出具體差異蛋白的蛋白點號，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)在Changliver_HBX的差異點有8個可以在HBV組中找到，而HepG2_HBX組的差異點只有2個能在HBV組找到，這兩個細(xì)胞系組別里只有1個共