人致癌物代謝酶及其自然變異體的功能研究.pdf

1、本研究以生物化學手段(酶反應學)和細胞及分子生物學手段側重研究了CYP2A13對AFB1的代謝活化能力及其功能，并與傳統(tǒng)的AFB1代謝酶CYP1A2進行比較，研究結果證明了CYP2A13是一種全新的、高效的AFB1代謝酶，這不僅為AFB1可誘發(fā)人肺癌提供了機理上的有力證據(jù)，而且為今后尋找CYP2A13特異性抑制劑并利用它們對AFB1所致肺癌進行化學預防提供了理論基礎。主要研究結果如下： 1.運用Sf9昆蟲細胞成功地在體外表達了人

2、CYP2A13蛋白，免疫印跡結果顯示，CYP2A13蛋白在約55kD附近顯示一條強帶，而對照蛋白(僅表達載體)則無此條帶；CYP2A13蛋白在波長為450nm處顯示特征性的吸收峰。 2.體外酶反應動力學結果顯示，CYP2A13代謝AFB1可生成包括具有毒性和致癌活性的環(huán)氧化物AFB1-epoxide和AFM1-epoxide在內的多種代謝產物，而對照蛋白則沒有。與傳統(tǒng)的AFB1代謝酶CYP1A2相比，在15μM和150μMAFB

3、1濃度下，CYP2A13代謝AFB1生成的AFM1-epoxide與CYP1A2基本相當，AFB1-epoxide為CYP1A2的三分之一，CYP2A13尚代謝生成許多未知的代謝產物。雖然CYP2A6也被認為是AFB1的代謝酶，但本研究結果顯示，在15μMAFB1濃度下，CYP2A6無代謝活性；即使在150μM濃度下，也未檢測到AFB1的環(huán)氧化代謝產物。 3.運用Flp-In系統(tǒng)在CHO細胞成功地建立了穩(wěn)定表達CYP2A13蛋白

4、的轉染細胞株(CHO-2A13)。Flp-InCHO是一個經(jīng)過改造過的細胞株，由于在CHO染色體上植入了FRT位點，運用特殊的載體(pcDNA5/FRT)可以保證所轉染的cDNA僅以單拷貝的方式插入到染色體的固定位點，避免了在一般的細胞轉染時通常存在的插入位點和拷貝數(shù)的不確定性，從而保證了轉染不同的cDNA都具有相同的蛋白表達效率，為比較不同蛋白的代謝活性提供了可靠的保證。研究結果顯示，盡管CYP2A13和CYP2A6在CHO細胞中具有

5、相同的表達水平，但AFB1對兩者的細胞毒性(LC50)相差了1000倍(40nMvs40μM，48小時)；與CHO-CYP1A2相比，其細胞毒性也相差了近6倍(220nMvs1.2μM，24小時)，而對CHO-CYP3A4的LC50至少為50μM。AFB1對CHO-CYP2A13的細胞毒性不僅具有劑量依賴性，而且呈時間依賴性。 4.通過對細胞周期的研究發(fā)現(xiàn)，AFB1阻斷CHO-2A13細胞分裂(G2/Marrest)呈劑量依賴性

6、(24小時)，而CYP1A2和CYP2A6僅在高劑量時，G2/Marrest與對照相比具有顯著性；AFB1染毒48小時，不僅CHO-2A13的細胞分裂受到破壞，其DNA合成(Sarrest)也受到明顯影響，而此刻僅CHO-1A2在高劑量時表現(xiàn)為G2/Marrest的升高。對細胞周期的影響可能與AFB1被CYP2A13代謝所形成的環(huán)氧化物與細胞DNA形成加合物并進而導致的DNA損傷有關。 5.運用三種典型的化合物進一步觀察CYP2

7、A13代謝活化AFB1的方式。丙烯酰胺不能被CYP2A13代謝也不引起細胞毒性，尼古丁可被CYP2A13代謝但不能引起細胞毒性，NNK既可被CYP2A13代謝也可引起細胞毒性。讓這三種化合物分別與AFB1共同處理CHO-2A13觀察它們的細胞毒作用。結果顯示，丙烯酰胺對AFB1所致的細胞毒作用無任何影響；尼古丁可劑量依賴性的抑制AFB1的毒作用，在100μM時幾乎完全抑制了AFB1的毒作用，這可能與尼古丁和AFB1在CYP2A13上具有

8、共同的作用靶點，兩者競爭作用的結果；NNK對AFB1的影響在低劑量時更符合單獨作用或相加作用的方式，等效劑量(20﹪的細胞死亡率)的NNK和AFB1可引起約40﹪的細胞死亡，這也符合各自的細胞毒作用機理，即兩者都是通過引起DNA損傷而對細胞產生毒作用，當然高劑量的聯(lián)合作用方式還需研究。 6.運用pcDNA5/FRT/V5-HisTOPO載體直接構建了CYP2A13質粒，該質粒的特點是在CYP2A13蛋白的C段帶有一段V5-His

9、的多肽。有趣的是該多肽大大降低了CYP2A13代謝活化AFB1的能力，這種作用也同樣表現(xiàn)在另外一種黃曲霉毒素AFG1上。雖然CYP2A5的代謝活化能力比CYP2A13強，但V5-His多肽對其功能幾乎無影響。此外，AFB1的代謝產物之一AFM1也被用來比較對CHO-2A13的毒作用，結果發(fā)現(xiàn)AFM1的毒性遠低于AFB1和AFG1，這是否意味著AFM1是AFB1的解毒性產物，相關研究有待進一步開展。 7.通過比較CYP2A6和CY

10、P2A13兩種蛋白的差異以及運用計算機模型對其蛋白質空間結構的分析，運用點突變技術人工構建了兩種可能對CYP2A13的活性產生影響的突變體Val117和Arg372。Val117代謝AFB1產生的環(huán)氧化代謝產物比野生型的多，而Arg372則完全喪失了活性；細胞毒性也顯示了相似的結果，AFB1對CHO-Val117的毒作用比野生性強5倍左右，而在相同條件下對CHO-Arg372幾乎無作用。實驗結果與實驗室過去研究的該兩種突變體對NNK的代

11、謝活性完全一致，進一步證實了?！?和＃372兩個位點的突變對CYP2A13活性的影響。 8.制備了CYP2A13特異性抗體，并運用體外表達的CYP2A5、CYP2A6、CYP2A13、CYP3A4蛋白以及大鼠肝臟微粒體蛋白對其特異性進行了評價，結果發(fā)現(xiàn)CYP2A13抗體僅與CYP2A13蛋白結合，與其他蛋白質無作用；而CYP2A6抗體(可與CYP2A5和CYP2A13有交叉反應)則能與CYP2A5、CYP2A6、CYP2A13蛋

12、白結合，且肝臟微粒體蛋白也呈陽性反應；研究結果充分顯示了CYP2A13抗體的特異性。此外，運用免疫組化方法檢測了人正常呼吸道組織及嗅覺上皮細胞中CYP2A13的表達，結果發(fā)現(xiàn)CYP2A13在肺氣管和支氣管上皮有很強的表達，而在肺泡中的表達則很弱，這與已報道的CYP2A13mRNA可在呼吸系統(tǒng)組織中被檢測到的結果完全一致，進一步證明了CYP2A13蛋白在呼吸系統(tǒng)中的表達；CYP2A13還在大腦嗅覺上皮細胞中高度表達，這項結果將為研究煙草代