基于雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)環(huán)境致癌物DNA損傷修復(fù)作用.pdf

1、目的:隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，越來(lái)越多的化合物投入生產(chǎn)。如此眾多的化學(xué)物質(zhì)中，致癌化學(xué)物質(zhì)占有相當(dāng)?shù)谋壤?。近年?lái)，我國(guó)腫瘤發(fā)病率升高明顯，顯然與環(huán)境致癌物的污染有關(guān)。在基因組的遺傳穩(wěn)定中，DNA損傷與修復(fù)具有十分重要的地位，因此對(duì)DNA損傷修復(fù)的檢測(cè)也已經(jīng)成為遺傳毒物對(duì)生物體早期損傷的生物標(biāo)記。目前已有多種不同的檢測(cè)方法應(yīng)用于環(huán)境致癌物對(duì)DNA損傷或修復(fù)的檢測(cè)。常用檢測(cè)DNA損傷的實(shí)驗(yàn)有微核實(shí)驗(yàn)、染色體畸變和彗星實(shí)驗(yàn)等。最近報(bào)道，可利用誘導(dǎo)基

2、因結(jié)合靈敏的報(bào)告基因檢測(cè)DNA損傷，常用的誘導(dǎo)基因有RAD51，RAD54和gadd153等。檢測(cè)DNA修復(fù)的方法主要有彗星實(shí)驗(yàn)和宿主細(xì)胞恢復(fù)活性實(shí)驗(yàn)(HCR)。HCR是一種細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染受損質(zhì)粒，檢測(cè)受損質(zhì)粒的修復(fù)情況，以反應(yīng)細(xì)胞對(duì)DNA的修復(fù)能力。然而上述檢測(cè)方法均為分別檢測(cè)DNA損傷或DNA修復(fù)作用。由于DNA受到損傷的同時(shí)可即刻啟動(dòng)細(xì)胞修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)，所以僅僅單獨(dú)檢測(cè)DNA損傷或者修復(fù)能力并不能準(zhǔn)確評(píng)價(jià)外來(lái)化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞DNA的損

3、傷作用。為系統(tǒng)評(píng)價(jià)環(huán)境致癌物對(duì)DNA的損傷和修復(fù)作用，本研究利用誘導(dǎo)基因GADD153-LUC檢測(cè)方法結(jié)合HCR檢測(cè)原理建立一種可同時(shí)檢測(cè)外源化學(xué)物質(zhì)對(duì)DNA損傷和修復(fù)作用的方法。
　　 方法:
　　 1細(xì)胞培養(yǎng)
　　 人肝母細(xì)胞瘤細(xì)胞株HepG2(中國(guó)武漢典型培養(yǎng)物保藏中心)于含10％熱滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)。利用RNA干擾技術(shù)，建立XRCC1低表達(dá)細(xì)胞株，于10％熱滅

4、活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5％CO2飽和濕度下培養(yǎng)。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
　　 2載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染
　　 pGadd153-LUC質(zhì)粒是一種包括gadd153啟動(dòng)子和熒光素酶報(bào)告基因的載體，本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建成功。pRL-TK質(zhì)粒是一種包含SV40啟動(dòng)子和海腎熒光素酶報(bào)告基因的載體，購(gòu)買于Clontech公司。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用胰酶消化后輕柔吹打制成單細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。按2×105個(gè)/ml接種

5、細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板，于含10％FCS血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞匯合度達(dá)95％時(shí)，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
　　 3宿主細(xì)胞恢復(fù)活性實(shí)驗(yàn)(HCR)
　　 氯化鎘損傷質(zhì)粒pRL-TK，乙醇沉降法回收受損質(zhì)粒，TE溶解沉淀，質(zhì)粒濃度定容為1μg/μl。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染受損質(zhì)粒和pGL3-LUC質(zhì)粒，不同致癌物染毒12小時(shí)后，檢測(cè)熒光強(qiáng)度，同時(shí)檢測(cè)樣品蛋白含量，以熒光強(qiáng)度/μg蛋白含量，來(lái)反應(yīng)DNA修復(fù)能力。
　　 4雙熒

6、光素酶報(bào)告基因檢測(cè)
　　 受損質(zhì)粒和pGadd153-LUC共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后以不同化學(xué)物質(zhì)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒，12小時(shí)后收獲細(xì)胞。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)樣品中雙熒光素酶的表達(dá)情況。檢測(cè)樣品蛋白含量，以熒光強(qiáng)度/μg蛋白含量分別表示蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的表達(dá)量。
　　 5彗星實(shí)驗(yàn)
　　 彗星實(shí)驗(yàn)是一種傳統(tǒng)的DNA損傷修復(fù)的檢測(cè)方法。本研究分別比較彗星實(shí)驗(yàn)與Gadd153-Luc檢測(cè)方法及H

7、CR實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)靈敏度。
　　 6土壤中非揮發(fā)性有機(jī)化合物的檢測(cè)
　　 土壤樣品分別采集于3個(gè)不同污染程度的電子垃圾污染區(qū)（居民區(qū)，垃圾焚燒廠，農(nóng)田），有機(jī)溶劑抽提法抽提土壤樣品中非揮發(fā)性的有機(jī)物。以雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)法和彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)提取物對(duì)HepG2細(xì)胞DNA的損傷與修復(fù)作用。
　　 結(jié)果:
　　 1宿主細(xì)胞恢復(fù)活性實(shí)驗(yàn)最佳實(shí)驗(yàn)條件的選擇
　　 氯化鎘處理質(zhì)粒的劑量與熒光素酶表達(dá)以及質(zhì)粒受損的

8、時(shí)間和熒光素酶表達(dá)的結(jié)果顯示，5μmol/L氯化鎘處理pRL-TK質(zhì)粒2小時(shí)后轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞可使約90％的DNA損傷修復(fù)。相同劑量和時(shí)間處理質(zhì)粒轉(zhuǎn)染修復(fù)基因缺陷的細(xì)胞XRCC1(-)細(xì)胞，僅有60％的損傷可被修復(fù)。因此，本研究選擇5μmol/L氯化鎘處理PRL-TK質(zhì)粒2小時(shí)后轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行DNA修復(fù)能力的檢測(cè)。
　　 2宿主細(xì)胞恢復(fù)活性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)已知環(huán)境致癌物對(duì)HepG2細(xì)胞DNA修復(fù)能力的影響
　　 宿主細(xì)胞恢復(fù)活性

9、試驗(yàn)檢測(cè)7種已知環(huán)境致癌物對(duì)HepG2細(xì)胞DNA修復(fù)能力的影響，并與彗星實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，HCR對(duì)其中5種環(huán)境致癌物影響DNA修復(fù)能力的檢測(cè)限值要低于彗星實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)限值。其中對(duì)于苯并芘，HCR的檢測(cè)限值比彗星實(shí)驗(yàn)低1000倍，對(duì)于氯化鎘，HCR的檢測(cè)限值比彗星實(shí)驗(yàn)低10倍。
　　 3雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)環(huán)境致癌物的DNA損傷修復(fù)能力
　　 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)16種已知環(huán)境致癌物對(duì)DNA損傷與修

10、復(fù)能力的影響。海腎熒光素酶的表達(dá)情況反應(yīng)細(xì)胞對(duì)DNA的修復(fù)能力，蟲熒光素酶的表達(dá)情況反應(yīng)DNA的損傷情況。結(jié)果顯示，16種有遺傳毒性的環(huán)境致癌物，雙熒光素酶報(bào)告基因的檢測(cè)限值與單獨(dú)gadd153-LUC檢測(cè)系統(tǒng)或者HCR的檢測(cè)限值，基本相同。本研究選擇3種無(wú)遺傳毒性的化學(xué)物質(zhì)，利用雙熒光素酶系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，均未見DNA損傷作用和對(duì)DNA修復(fù)能力的影響。
　　 4雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)土壤中非揮發(fā)性有機(jī)物提取物對(duì)HepG2細(xì)胞D

11、NA損傷和修復(fù)的作用
　　 來(lái)自三個(gè)不同污染區(qū)的土壤中非揮發(fā)性有機(jī)提取物均可誘導(dǎo)蟲熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，說(shuō)明該土壤中非揮發(fā)性有機(jī)物可誘導(dǎo)DNA損傷，強(qiáng)度為居民區(qū)＞垃圾焚燒廠＞農(nóng)田土壤;同時(shí)該有機(jī)提取物可降低海腎熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)，說(shuō)明土壤中非揮發(fā)性有機(jī)物具有降低DNA修復(fù)能力的作用，強(qiáng)度為居民區(qū)＜垃圾焚燒廠＜農(nóng)田土壤。彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)土壤中非揮發(fā)性有機(jī)提取物對(duì)DNA的損傷情況。彗星實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)結(jié)

12、果一致。
　　 結(jié)論:
　　 1本研究建立了可同時(shí)檢測(cè)環(huán)境致癌物對(duì)DNA損傷與修復(fù)能力的雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)。
　　 2環(huán)境致癌物對(duì)DNA的損傷修復(fù)情況，可以通過(guò)檢測(cè)蟲熒光素酶的表達(dá)活性來(lái)反應(yīng)細(xì)胞DNA受損的程度，檢測(cè)海腎熒光素酶的表達(dá)活性來(lái)反映DNA的修復(fù)水平。
　　 3應(yīng)用重組細(xì)胞系統(tǒng)對(duì)多種致癌物和環(huán)境樣品進(jìn)行DNA損傷與修復(fù)能力的檢測(cè)，本研究結(jié)果表明該檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)大部分致癌物質(zhì)和實(shí)際環(huán)境樣品均有