人喉癌細(xì)胞免疫逃避機(jī)制研究.pdf

1、目的： 免疫系統(tǒng)與惡性腫瘤細(xì)胞之間相互作用在腫瘤發(fā)生中扮演重要角色。免疫系統(tǒng)不能及時(shí)識(shí)別及殺傷惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能會(huì)導(dǎo)致癌癥發(fā)生。惡性腫瘤通過(guò)多種機(jī)制逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視。目前已知許多這些機(jī)制是在細(xì)胞和分子水平。其中，腫瘤通過(guò)不同機(jī)制形成利于自身增殖的微環(huán)境，誘導(dǎo)微環(huán)境中活化T淋巴細(xì)胞凋亡而逃逸腫瘤監(jiān)控機(jī)制越來(lái)越受到重視。 本研究通過(guò)觀察人喉癌Hep-2細(xì)胞對(duì)Jurkat細(xì)胞凋亡的影響，探討Fas、FasL促凋亡途徑在人喉癌細(xì)

2、胞免疫逃避中的作用；并進(jìn)一步探討MMP-7調(diào)控Hep-2細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞相互作用的機(jī)制。通過(guò)研究MMP-7、Fas、FasL在喉癌組織的表達(dá)，探討其與喉癌患者臨床病理特征的關(guān)系。 方法： 1.應(yīng)用RT-PCR、流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hep-2細(xì)胞表面Fas、FasL的mRNA及蛋白表達(dá)；Hep-2細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)，應(yīng)用MTT比色試驗(yàn)描繪Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，應(yīng)用Hoechst染色熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞

3、術(shù)檢測(cè)Jurkat細(xì)胞凋亡情況。 2.采用RT-PCR檢測(cè)Hep-2細(xì)胞中MMP-7的mRNA表達(dá)；采用免疫組化技術(shù)觀察Hep-2細(xì)胞MMP-7蛋白的表達(dá)情況：用不同終濃度(10ng/mL、100ng/mL、200ng/mL)的重組人MMP-7(RecombinanthumanMMP-7，rhMMP-7)預(yù)處理培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，或同時(shí)加入MMP-7中和性IgG抗體1.0μg/mL，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)檢測(cè)培養(yǎng)上

4、清液中可溶性FasL(solubleFasL，sFasL)水平。分別培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞及Jurkat細(xì)胞，將細(xì)胞進(jìn)行不同處理并分為以下5組，(1)A組：Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入活化重組人MMP-7(終濃度100ng/mL)后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液孵育Jurkat細(xì)胞(1×105/mL)；(2)B組：Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)液中加入活化重組人MMP-7(終濃度100ng/mL)預(yù)處理后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，再加入10μg/mL的FasL中和性抗

5、體NOK-1，孵育1h后，再孵育Jurkat細(xì)胞(1×105/mL)；(3)對(duì)照1組：直接收集Hep-2細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)上清液孵育Jurkat細(xì)胞(1×105/mL)；(4)對(duì)照2組：普通細(xì)胞培養(yǎng)液中加入rhMMP-7(終濃度100ng/mL)預(yù)處理后，孵育Jurkat細(xì)胞(1×105/mL)；(5)對(duì)照3組：用普通細(xì)胞培養(yǎng)液直接孵育Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)(1×105/mL)；各試驗(yàn)組在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12及24小時(shí)，收集懸

6、浮Jurkat細(xì)胞，分別采用MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)Jurkat細(xì)胞增殖情況；流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)；Hoechst染色觀察Jurkat細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀檢測(cè)Jurkat細(xì)胞凋亡情況； 3.65例配對(duì)的喉癌組織和癌旁非瘤組織標(biāo)本采集自接受手術(shù)的喉癌患者。采用免疫組化染色檢測(cè)MMp-7、Fas、FasL的表達(dá)情況，分析各檢測(cè)指標(biāo)與喉癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，并進(jìn)行MMP-7與Fas、FasL相關(guān)性分析。 結(jié)果：

7、 1.流式細(xì)胞儀檢測(cè)Hep-2細(xì)胞表面Fas及FasL表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度分別為(25.57±7.1)和(32.91±5.6)。Jurkat細(xì)胞表面Fas及FasL表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度分別為(65.39±4.6)和(66.48±5.7)。Hep-2細(xì)胞(密度為1×106/mL)分別與的Jurkat細(xì)胞(密度為1×105/mL、5×105/mL)共培養(yǎng)24h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Jurkat細(xì)胞凋亡率為(38.95±0.11)％和(13.28±0

8、.14)％，而Jurkat細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)的凋亡率為(7.53±0.17)％，共培養(yǎng)組Jurkat細(xì)胞較單獨(dú)培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)。MTT比色試驗(yàn)檢測(cè)顯示共培養(yǎng)后Jurkat細(xì)胞生長(zhǎng)受到明顯抑制；當(dāng)共培養(yǎng)體系中加入FasL中和性抗體NOK-1后，Jurkat細(xì)胞凋亡率顯著下降(P<0.01)。 2.RT-PCR檢測(cè)顯示Hep-2細(xì)胞中表達(dá)MMP-7的mRNA；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，MMP-7在Hep-

9、2細(xì)胞呈陽(yáng)性表達(dá)，MMP-7表達(dá)于Hep-2細(xì)胞胞漿中，而細(xì)胞核中表達(dá)陰性。分別加入10ng/mL、100ng/mL、200ng/mLrhMMP-7孵育后，Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清中sFasL水平分別為0.83±0.182、1.27±0.244、1.64±0.193(ng/mL)，較單純Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液水平0.55±0.084(ng/mL)顯著升高(P<0.05)，且上清液中sFasL濃度與MMP-7濃度存在濃度依賴(lài)性(P<0.0

10、5)。當(dāng)加入抗人MMP-7特異性IgG抗體共同孵育，上清液中sFasL含量顯著減少。MTT比色試驗(yàn)顯示，在A組Jurkat細(xì)胞增殖較對(duì)照組均明顯降低(P<0.05)，而在B組，Hep-2細(xì)胞經(jīng)MMP-7處理后，收集上清并加入NOK-1孵育處理，再將處理后的上清液孵育Jurkat細(xì)胞，Jurkat細(xì)胞增殖速度明顯恢復(fù)。Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)12h時(shí)，在A組，細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，相應(yīng)伴隨著S期細(xì)胞比例的減少。而G2/M期的細(xì)胞比例沒(méi)有

11、受到顯著影響。Hoechest染色法對(duì)各組Jurkat細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示，A組大量細(xì)胞出現(xiàn)了熒光變強(qiáng)，核固縮、碎裂等細(xì)胞凋亡的特征性改變，而在NOK-1中和了sFasL作用后及其他對(duì)照組，這種典型的細(xì)胞凋亡染色改變明顯減少。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，A組Jurkat細(xì)胞凋亡率(26.37±1.65)％，較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)。 3.喉癌組織中MMP-7蛋白陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織(64.6％VS43.1％，P<0.05

12、)；喉癌組織中FasL蛋白陽(yáng)性率顯著高于癌旁組織(64.6％VS21.5％，P<0.05)；癌旁組織中Fas蛋白陽(yáng)性率顯著高于喉癌組織(73.8％VS55.4％，P<0.05)；MMP-7在聲門(mén)上型與聲門(mén)型喉癌組間、不同腫瘤分期組間及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間的表達(dá)有顯著差異(P<0.05)，而在不同病理組織分化組間的表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)；FasL在中低分化喉癌組陽(yáng)性表達(dá)明顯高于在高分化組(P<0.05)，但FasL蛋白表達(dá)與臨床分期

13、及是否伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及與腫瘤原發(fā)位置無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)；Fas在高分化組陽(yáng)性表達(dá)顯著高于中低分化喉癌組(P<0.05)，而在不同原發(fā)位置組間、不同腫瘤分期組間及有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間表達(dá)無(wú)顯著差異(P>0.05)；喉癌組織中MMP-7與Fas表達(dá)具有顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，而與FasL表達(dá)無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。 結(jié)論： 1.喉癌細(xì)胞與Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)能誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是人喉癌細(xì)