CTLA-4胞外段與HBsAg融合DNA疫苗增強(qiáng)抗HBV免疫的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(Hepatitis Bvirus，HBV)感染是世界性的公共衛(wèi)生問題，HBV感染所致的慢性肝炎及其并發(fā)癥嚴(yán)重危害了人類健康。目前臨床上對慢性肝炎的治療主要是采用α干擾素和核苷類藥物進(jìn)行抗病毒治療，但它們清除HBV cccDNA的作用有限，因此急需新的治療策略。 本研究分以下四部分。 第一部分 CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 目的： 構(gòu)建CTLA-4胞外段與

2、HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒，并在體外對其進(jìn)行鑒定，以用于后續(xù)DNA免疫的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究。 方法： 通過RT-PCR和PCR法分別獲得小鼠的CTLA-4胞外段和HBsAg基因，采用分子克隆基本技術(shù)將獲得的目的基因分別插入至分泌型質(zhì)粒pSecTagB中，獲得重組質(zhì)粒pCTLA和pS，再以pCTLA為骨架，采用分子克隆法將HBsAg基因插入pCTLA中的CTLA-4基因的3'端，從而得到融合表達(dá)質(zhì)粒pCTLA-S。全自動(dòng)序列分析

3、儀驗(yàn)證序列正確后，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至真核細(xì)胞Cos-7，分別用RT-PCR和放免法檢測目的基因mRNA和HBsAg的表達(dá)。 結(jié)果： 測序分析結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pCTLA、pS和pCTLA-S中插入了正確的基因序列。RT-PCR法檢測pCTLA、pS和pCTLA-S轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞中均有特異性目的基因mRNA的表達(dá)，放免法檢測表明pS和pCTLA-S轉(zhuǎn)染Cos-7的胞內(nèi)和胞外均有HBsAg的表達(dá)。

4、 結(jié)論： 成功構(gòu)建了CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒pCTLA-S及對照重組質(zhì)粒pCTLA和pS，并能在真核細(xì)胞內(nèi)有效表達(dá)。 第二部分 CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒免疫增強(qiáng)小鼠抗HBsAg免疫應(yīng)答的研究 目的： 研究CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒免疫增強(qiáng)小鼠抗HBsAg免疫應(yīng)答的特點(diǎn)，探討該融合重組質(zhì)粒免疫用于抗HBV感染的治療的可行性。

5、 方法： 將重組質(zhì)粒pCTLA-S及對照重組質(zhì)粒pCTLA、pS和pSecTagB經(jīng)超純質(zhì)粒大量抽提后，常規(guī)肌肉免疫BALB/c小鼠后，采用ELISA法動(dòng)態(tài)檢測小鼠血清抗-HBs；在加強(qiáng)免疫4周后處死一半小鼠(4只)，無菌取單個(gè)脾細(xì)胞，用MTT法檢測HBsAg特異性淋巴細(xì)胞增殖活性，LDH法檢測HBsAg特異性的CTL反應(yīng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測脾細(xì)胞中HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞；ELISA法檢測HBsAg特異性IgG亞類和培養(yǎng)脾細(xì)

6、胞HBsAg特異性的IFN-γ和IL-4的分泌水平。 結(jié)果： 動(dòng)態(tài)檢測小鼠血清抗-HBs結(jié)果表明，pCTLA-S免疫后，抗體在初次免疫2周后開始上升，至免疫后8周達(dá)到高峰，此后緩慢下降，至免疫后16周仍有較高水平的抗體；pCTLA-S免疫組與未融合質(zhì)粒pS免疫組相比，其抗體出現(xiàn)的時(shí)間明顯提前，滴度亦顯著升高，pCTLA-S免疫組最高可達(dá)7123mIU/ml，而pS最高僅為261mIU/ml，升高達(dá)數(shù)百倍(pCTLA-S

7、vs pS，P<0.0001)。 結(jié)論： pCTLA-S不僅顯著增強(qiáng)小鼠抗HBsAg的特異性抗體免疫應(yīng)答，而且顯著增強(qiáng)HBsAg特異性T細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷功能，有效誘導(dǎo)HBsAg特異性的CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ，促進(jìn)Tc1細(xì)胞增殖，顯著增強(qiáng)了HBsAg特異性的Th免疫應(yīng)答，預(yù)示著該融合質(zhì)粒免疫可能在抗HBV感染治療中具有潛在的應(yīng)用前景。 第三部分CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒免疫在

8、HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中的抗病毒效應(yīng)及其誘導(dǎo)的抗HBsAg免疫應(yīng)答的研究 目的： 觀察融合重組表達(dá)質(zhì)粒pCTLA-S免疫對HBV轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg小鼠)中HBV的免疫清除作用，并對其在HBV轉(zhuǎn)基因鼠中的免疫應(yīng)答進(jìn)行研究，探討pCTLA-S免疫對HBV持續(xù)感染的治療作用和應(yīng)用前景。 方法： 重組質(zhì)粒pCTLA-S及對照重組質(zhì)粒pS和pSecTagB經(jīng)超純質(zhì)粒大量抽提后，常規(guī)肌肉免疫Tg小鼠后，分別采用放免法(RIA

9、)和ELISA法動(dòng)態(tài)檢測血清HBsAg和抗-HBs水平，熒光定量PCR法檢測血清HBV DNA滴度；在加強(qiáng)免疫4周后處死一半小鼠，無菌取單個(gè)脾細(xì)胞，用MTT法檢測HBsAg特異性淋巴細(xì)胞增殖活性，LDH法檢測HBsAg特異性的CTL反應(yīng)，流式細(xì)胞術(shù)檢測脾細(xì)胞中HBsAg特異性CD8+T細(xì)胞，ELISA法檢測培養(yǎng)脾細(xì)胞HBsAg特異性的IFN-γ和IL-4的分泌水平；常規(guī)化學(xué)比色法檢測血清ALT水平；病理切片常規(guī)HE染色及免疫組化分析肝臟

10、組織學(xué)及HBsAg表達(dá)。 結(jié)果： 融合質(zhì)粒pCTLA-S免疫組有效下調(diào)血清HBV DNA和HBsAg水平，且與pS組相比，其下調(diào)作用更迅速、更明顯，尤其在免疫后8、12、16周，其下調(diào)作用自初次免疫后2周開始，以后逐漸增強(qiáng)，于免疫后8周下調(diào)效果十分明顯(其中實(shí)驗(yàn)組中有1只測不到HBV DNA，即<1×103copies/ml)，以后維持在較低水平，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束，在實(shí)驗(yàn)的16周內(nèi)沒有任何反彈(16周時(shí)，HBVDNA滴度的對

11、數(shù)pCTLA-S vs pS：3.58±0.09 vs 4.46±0.18，P<0.05；HBsAg抑制率pCTLA-S vs pS為：33.2±4.6％ vs 17.04±2.76％，p<0.01)。 結(jié)論： 在HBV-Tg小鼠中，融合重組表達(dá)質(zhì)粒pCTLA-S免疫比非融合的pS免疫能誘導(dǎo)出更強(qiáng)的HBsAg特異性的抗體應(yīng)答；增強(qiáng)HBsAg特異性的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞殺傷功能，有效誘導(dǎo)HBsAg特異性的CD

12、8+T細(xì)胞分泌IFN-γ，促進(jìn)Tc1細(xì)胞增殖，增強(qiáng)Th應(yīng)答，對HBV-Tg小鼠血清HBsAg、HBV DNA水平有明顯的抑制作用。 第四部分 CTLA-4胞外段與HBsAg融合表達(dá)重組質(zhì)粒免疫增強(qiáng)抗HBV免疫應(yīng)答機(jī)制的初步研究 目的： 構(gòu)建一個(gè)含突變的CTLA-4胞外段與HBsAg融合的重組表達(dá)質(zhì)粒pmCTLA-S，該突變是將CTLA-4胞外區(qū)的MYPPPY基序中的104位酪氨酸殘基的密碼子突變?yōu)楸彼崦?/p>

13、碼子。通過免疫正常和轉(zhuǎn)基因小鼠，觀察pmCTLA-S的免疫應(yīng)答特點(diǎn)和抗病毒作用，初步研究融合表達(dá)質(zhì)粒pCTLA-S抗HBV免疫增強(qiáng)機(jī)理。 方法： 用PCR法擴(kuò)增突變的CTLA-4胞外段，采用分子克隆基本技術(shù)將獲得的突變的CTLA-4胞外段插入至切除CTLA-4胞外段的pCTLA-S質(zhì)粒中，構(gòu)建得到含突變的CTLA-4胞外段的融合質(zhì)粒pmCTLA-S。全自動(dòng)序列分析儀驗(yàn)證pmCTLA-S序列正確后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞Cos

14、-7，放免法(RIA)檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞HBsAg的表達(dá)，用流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)上清中融合表達(dá)蛋白mCTLA-S中突變的CTLA-4與B7結(jié)合力，將突變的pmCTLA-S質(zhì)粒分別免疫BALB/c和HBV-Tg小鼠，采用ELISA、MTT和LDH等方法檢測pmCTLA-S免疫對小鼠抗HBsAg特異性抗體應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響；分別用熒光定量PCR和RIA檢測pmCTLA-S免疫對小鼠血清HBV DNA滴度和HBsAg的表達(dá)水平的影響。

15、結(jié)果： 測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pmCTLA-S中插入的突變的CTLA-4胞外段基因序列完全正確；放免法檢測表明pmCTLA-S的目的基因在Cos-7細(xì)胞有效表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測表明，pmCTLA-S表達(dá)的突變CTLA-4與B7結(jié)合力較未突變pCTLA-S明顯下降，結(jié)合力約為未突變CTLA-4的1/4(平均熒光強(qiáng)度MIF：12.3vs 3.06)。研究pmCTLA-S誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答表明，pmCTLA-S免疫誘導(dǎo)的小鼠抗-HBs比未

16、突變pCTLA-S顯著降低(各周抗體滴度pmCTLA-S vs pCTLA-S，均p<0.001)，且與pS所誘導(dǎo)的抗體滴度無顯著性差異(各周抗體滴度pmCTLA-S vs pS，均p>0.05)；pmCTLA-S免疫后小鼠的無論是細(xì)胞增殖活性還是CTL應(yīng)答與pS免疫組相比并未見有意義的升高(均p>0.05)，與pCTLA-S免疫組相比細(xì)胞增殖活性和CTL活性均明顯下降(pmCTLA=S vs pCTLA-S，SI：2.54±0.75

17、vs 4.05±0.47，P<0.01；CTL活性：E/T=40，17.5±3.2％ vs 27.0±2.8％，p<0.05)；進(jìn)一步檢測pmCTLA-S免疫對HBV Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg的影響，發(fā)現(xiàn)pmCTLA-S免疫對Tg小鼠血清HBV DNA和HBsAg表達(dá)均有一定的抑制作用，其抑制效應(yīng)與pS基本一致(均P>0.05)，但與pCTLA-S免疫相比抑制效應(yīng)明顯下降，尤其在免疫后8周兩組差異最為顯著(pmCTLA-S