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文檔簡介
1、目的:觀察重組人內(nèi)抑素(recombinant human endostatin,rh-Endostatin)對佐劑性關(guān)節(jié)炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)周期及其相關(guān)基因表達的影響,探討其抑NAAFLS增殖的細胞與分子機制,為類風濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)藥物治療及尋找治療新靶點提供實驗依據(jù)。
2、 方法:①AA大鼠模型的制備:雄性SD大鼠,6-7周齡,體重160-170g,后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑(Freund's complete adjuvant,CFA)0.1ml致炎。②動物分組及給藥:造模后d10,將AA誘導(dǎo)的大鼠分為AA組、rh-Endostatin組和甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)組,其中rh-Endostatin組于造模后d 10開始,連續(xù)7d腹部皮下注射給藥(2.5mg·kg-1·d-1),MT
3、X組于造模后d10和d16腹部皮下注射給藥(1.0mg·kg-1·d-1),d26處死大鼠用于后繼實驗。③實時熒光定量PCR(RT-FQ-PCR)檢測各組大鼠滑膜組織中周期相關(guān)基因p53、p21、周期蛋白依賴性激酶-4(cyclin-dependentkinase4,CDK)、細胞周期素D1(CyclinD1)和增殖細胞核抗原(preliferation cell nuclear antigen,PCNA)mRNA的表達。④Wester
4、n blot法檢測各組大鼠滑膜組織中PCNA和CyclinD1蛋白的表達。⑤組織塊移植法培養(yǎng)細胞及鑒定FLS:取正常組和AA組大鼠滑膜組織作細胞培養(yǎng),流式細胞儀(flomcytometry,F(xiàn)CM)檢測傳2代的AA組大鼠滑膜細胞中血管細胞粘著分子(vascularcell adhesion molecule-1,VCAM-1)的表達。@FCM檢測各組FLS的周期:將AAFLS均分為AA組、rh-Endostatin(50 μg·ml-1
5、)組和MTX(1μg·ml-1)組,加藥培養(yǎng)48h后和正常組FLS同時上機檢測。 結(jié)果:①大鼠致炎后d10即可出現(xiàn)繼發(fā)性炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為四肢足爪腫脹,耳、尾出現(xiàn)炎性結(jié)節(jié)和紅斑并伴有體重減輕。造模后d 26,光鏡下可見其滑膜組織水腫、大量炎性細胞浸潤、滑膜細胞過度增殖等。②與AA組相比,rh-Endostatin組大鼠滑膜組織rbp53和p21mRNA表達水平降低,CDK4 mRNA的表達水平顯著增高。rh-Endostatin
6、組滑膜組織中CyclinD1和PCNAmRNA及其蛋白的表達量均低于AA組,以上差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。③傳2代培養(yǎng)的AA大鼠滑膜細胞經(jīng)FCM鑒定,VCAM-1表達率為94.2%。④rh-Endostatin使AA FLS細胞周期G0/G1期的比例由10%上升到74.1%,S期和G2/M期分別由65.6%、19.5%下降到12.6%、4.15%。 結(jié)論:①傳2代培養(yǎng)的AA大鼠滑膜細胞主要為FLS。②rh-Endost
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