骨性關(guān)節(jié)炎患者滑膜成纖維樣細(xì)胞Notch分子表達(dá)及作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的:
　　 骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨變性、破壞，關(guān)節(jié)滑膜炎以及骨質(zhì)增生為主要病理特征的常見風(fēng)濕性疾病。長(zhǎng)期以來對(duì)OA的研究主要集中于關(guān)節(jié)軟骨和軟骨細(xì)胞，但是越來越多的證據(jù)已表明，滑膜的炎癥反應(yīng)在有癥狀的OA患者中普遍存在，而且與臨床表現(xiàn)出的癥狀相關(guān)。有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號(hào)途徑不僅參與胚胎的發(fā)育，也參與了多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。目前該信號(hào)途徑與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoidar

2、thritis，RA)等炎癥性自身免疫性疾病的關(guān)系已受到越來越多人的重視。本研究的目的:建立滑膜細(xì)胞原代培養(yǎng)方法并比較正常人與OA患者成纖維樣滑膜細(xì)胞Notch受體在mRNA水平表達(dá)的差異。并進(jìn)一步證實(shí)Notch信號(hào)在調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞分泌細(xì)胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶中所發(fā)揮的作用。通過本研究可望進(jìn)一步明確OA的發(fā)病機(jī)制，并為發(fā)展基于干預(yù)Notch信號(hào)的免疫治療提供理論依據(jù)。
　　 研究方法:
　　 (1)通過組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行滑膜

3、細(xì)胞原代培養(yǎng)，原代細(xì)胞傳至3-5代，采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)的純度。
　　 (2)采用熒光定量PCR比較正常人與OA患者FLS的Notch受體mRNA水平表達(dá)，并以LPS(10ng/ml)或LPS(10ng/ml)+DAPT(5μmol)刺激OA患者FLS，通過熒光定量PCR和Western-blot方法檢測(cè)Notch受體及其下游靶基因在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。分析炎性刺激或DAPT非特異性阻斷對(duì)

4、OAFLSNotch受體的影響。
　　 (3)熒光定量PCR分析上述處理組OAFLS細(xì)胞因子IL-6，IL-8及基質(zhì)金屬蛋白酶mRNA水平的表達(dá)。采用流式芯片技術(shù)檢測(cè)上述處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的表達(dá)，探討Notch信號(hào)途徑對(duì)OAFLS細(xì)胞因子及基質(zhì)金屬蛋白酶以及其分泌的細(xì)胞因子的影響。
　　 研究結(jié)果:
　　 (1)組織塊培養(yǎng)法原代培養(yǎng)的FLS傳至第3代時(shí)可呈現(xiàn)典型的梭形形態(tài);FCM檢測(cè)到CD90在FLS上

5、的表達(dá)率可達(dá)96.73％。
　　 (2)Notch4受體在正常人或OA患者FLS表達(dá)均較低，但OA患者滑膜細(xì)胞Notch受體1、2、3以及Hes-1mRNA表達(dá)水平明顯高于正常人（P＜0.05）。提示OAFLSNotch信號(hào)活化程度高于正常人，且經(jīng)γ-分泌酶抑制劑(DAPT)非特異性阻斷后，與對(duì)照組相比Notch受體1、2、3以及Hes-1mRNA表達(dá)明顯下降。
　　 (3)OAFLS可產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-6和IL-8。同

6、時(shí)，滑膜細(xì)胞也表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶尤其以MMP3和MMP9為主。而經(jīng)LPS刺激以后，Notch信號(hào)明顯活化同時(shí)，上述細(xì)胞因子與基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)也明顯增高(P＜0.05);流式芯片檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，炎性刺激可誘導(dǎo)OAFLS分泌大量的細(xì)胞因子，而DAPT非特異性阻斷Notch信號(hào)后OAFLS培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子的含量降低（P＜0.05）。
　　 結(jié)論:
　　 (1)采用滑膜組織組織塊貼壁培養(yǎng)法可成功構(gòu)建

7、骨性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型。
　　 (2)OAFLSNotch受體及下游靶基因Hes-1mRNA水平表達(dá)較正常人FLS高，經(jīng)DAPT處理后Notch信號(hào)活化受到明顯抑制。提示OA患者滑膜細(xì)胞Notch信號(hào)可能存在異常活化。
　　 (3)LPS刺激可誘導(dǎo)OAFLSIL-6，IL-8等炎性因子和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)增高，而DAPT處理后滑膜細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶和細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子IL-6的表達(dá)明顯降低，提示