非選擇性鉀離子通道阻斷劑對多西紫杉醇抗人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S作用的影響.pdf

1、前言: 乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈不斷上升趨勢。鉀通道電流(Ik)在腫瘤細(xì)胞中的生物物理特性及其在腫瘤細(xì)胞生長中的調(diào)控作用已經(jīng)被廣泛研究。研究發(fā)現(xiàn)，Ix在腫瘤細(xì)胞增殖中具有促進(jìn)作用，促進(jìn)Ik傳導(dǎo)的各種因子如纈氨霉素、泌乳素、胎牛血清等可刺激腫瘤細(xì)胞增殖；Ik阻斷劑如四乙胺(TEA)、4-氨基吡啶(4-AP)等既能抑制各種腫瘤細(xì)胞中的Ik，又能抑制這些細(xì)胞的增殖。鉀離子通道作為腫瘤細(xì)胞增殖關(guān)鍵調(diào)控物觀點(diǎn)，近來已經(jīng)

2、被許多實(shí)驗及臨床證據(jù)所認(rèn)同。鉀離子通道活性的增加與增殖速率的提高有關(guān)，但是，鉀離子通道調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制尚不甚明了. 抗腫瘤藥多西紫杉醇(DOC)是由植物Taxus baccata針葉中提取巴卡丁(baccatin)經(jīng)半合成改造而成，其基本結(jié)構(gòu)類似紫杉醇，但水溶性較高。其為細(xì)胞有絲分裂抑制劑，通過促進(jìn)小管聚合成穩(wěn)定的微管抑制其解聚，使游離小管的數(shù)量明顯減少而影響細(xì)胞的有絲分裂，導(dǎo)致細(xì)胞周期的變化，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞生長的作

3、用。 目的: 1、DOC、非選擇性鉀離子通道阻斷劑4-AP及DOC與4-AP聯(lián)合應(yīng)用對人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。 2、明確非選擇性鉀離子通道阻斷劑4-AP對DOC抗人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S作用的影響機(jī)制，為開發(fā)一種多靶點(diǎn)治療乳腺癌方案提供理論依據(jù)。 方法: 1、MTT比色法檢測藥物對MDA-MB-435S細(xì)胞增殖的影響：取對數(shù)生長期細(xì)胞接種孵育

4、，藥物處理24、48、72h后，每孔加5μg·μL-1的MTT 10μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄液，每孔加DMSO 100μl，60 rpm振蕩10 min，ELx800通用型酶標(biāo)儀于570 mm處測OD值，并計算增殖抑制率。抑制率計算如下：抑制率(％)=(對照孔OD均值-實(shí)驗孔OD均值)/對照孔OD均值×100％。 2、流式細(xì)胞術(shù)Annexin V-FITC/PI雙染法檢測藥物對MDA-MB-435S細(xì)胞凋亡的影響：取對數(shù)生

5、長期細(xì)胞接種，藥物處理24 h后收集細(xì)胞，1000 rpm離心10 mim，棄上清,加入103μl冰冷的PBS使細(xì)胞懸浮，重復(fù)以上步驟兩次，然后將細(xì)胞重懸于200 μl Binding Buffer中，加入10 μl Annexin V-FITC和5μl PI混勻，室溫避光反應(yīng)15 min，加入300 μl Binding Buffer混勻，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。 3、流式細(xì)胞術(shù)PI單染法檢測藥物對MDA-MB-435

6、S細(xì)胞周期的影響：取對數(shù)生長期細(xì)胞接種，藥物處理24 h后收集細(xì)胞，1000 rpm離心5-min，棄上清，加入103μl冰冷的PBS使細(xì)胞懸浮，重復(fù)以上步驟3次后緩緩加入103μl冰冷的75％乙醇，4℃過夜，次日，1500 rpm離心10 min，小心棄上清后加入103μl冰冷的PBS使細(xì)胞懸浮，1500 rpm離心5 min后小心棄上清，加入0.1μg·μL-1PI和0.1μg·μL-1 Rnase A各500μl，37℃培養(yǎng)40

7、min后流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。 實(shí)驗結(jié)果: 1、DOC、4-AP單獨(dú)應(yīng)用均能抑制MDA-MB-435S的增殖；5×103 μmol·L-1的4-AP合用25 μmol·L-1的DOC對MDA-MB-435S達(dá)最大抑制率的時間明顯縮短，由72 h縮短到24 h；DOC和4-AP對MDA-MB-435S的增殖抑制有相加作用，并呈劑量-時間依賴性。 2、2 μmol·L-1和5 μmol·L-1的DOC單獨(dú)作用24

8、h，MDA-MB-435S產(chǎn)生細(xì)胞凋亡并不明顯，當(dāng)與5x103 μmol·L-1的4-AP聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞凋亡和死亡明顯增加，晚期凋亡和死亡細(xì)胞由對照組的6.99％±1.15％增加到2 μmol·L-1 DOC+5×103μmol·L-1 4-AP組的20.67％±0.91％和5 μmol·L-1 DOC+5×103μmol·L-1 4-AP組的11.98％±0.93％，這種變化隨DOC劑量的增加而愈加明顯。 3、單獨(dú)應(yīng)用DOC

9、可使MDA-MB-435S阻斷在G2/M期，細(xì)胞比率由對照組的7.41％±2.89％增加到2μmol·L-1 DOC組的30.73％±1.69％和5μmol·L-1 DOC組的76.26％±0.84％；單獨(dú)應(yīng)用4-AP可使MDA-MB-435S阻斷在G0/G1期，細(xì)胞比率由對照組的70.79％±0.62％增加到5×103μmol·L-1 4-AP組的75.73％±0.40％；兩藥聯(lián)合應(yīng)用可使MDA-MB-435S阻斷在G2/M期，2μm

10、ol·L-1DOC+5×103μmol·L-1 4-AP組的細(xì)胞比率為25.86％±0.92％，5μmol·L-1 DOC+5×103μmol·L-14-AP組的細(xì)胞比率為40.02％±1.67％，這種變化隨DOC劑量的增加而愈加明顯。 結(jié)論: 1、DOC抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S在G2/M期的增殖，可劑量依賴性誘導(dǎo)MDA-MB-435S細(xì)胞凋亡； 2、4-AP抑制人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-435S在