CDH1調(diào)控EGFR和DIRAS3表達及功能的機制研究.pdf

1、第一部分，CDH1調(diào)控EGFR和DIRAS3表達及功能的機制研究
　　研究背景和目的：
　　癌癥已經(jīng)成為人類最主要的致死疾病之一，嚴(yán)重威脅人們的壽命，大多數(shù)惡性腫瘤患者死于腫瘤的擴散轉(zhuǎn)移?？梢?，腫瘤轉(zhuǎn)移的研究對腫瘤治療有著重要的意義。EGFR屬于受體酪氨酸蛋白激酶家族。一旦激活，EGFR細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生磷酸化后激活PI3K，STAT，MAPK，Src等下游信號通路，調(diào)控細(xì)胞的增殖，存活，遷移和分化等多個生物學(xué)過程。

2、EGFR的高表達和過度活化在腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移中普遍存在。
　　上皮型鈣粘素(CDH1/E-cadherin)是介導(dǎo)同型細(xì)胞連接的鈣依賴的粘附分子，CDH1表達下調(diào)通過打破細(xì)胞間粘附以及改變基因的轉(zhuǎn)錄表達促進癌癥的轉(zhuǎn)移。同時，CDH1的缺失參與腫瘤轉(zhuǎn)移的重要步驟EMT的發(fā)生。從而，低水平的CDH1與腫瘤的轉(zhuǎn)移，病人的不良預(yù)后密切相關(guān)。因此，EGFR和CDH1已經(jīng)成為近年來腫瘤轉(zhuǎn)移研究的熱點分子。
　　研究表明CDH1與EGFR之

3、間存在相互調(diào)控，兩者之間的相互作用影響多種癌癥的發(fā)生發(fā)展。EGFR通過上調(diào)CDH1轉(zhuǎn)錄抑制因子Twist和Slug的表達，下調(diào)CDH1進而促進癌癥細(xì)胞的EMT轉(zhuǎn)換能力。另外，CDH1介導(dǎo)的細(xì)胞連接和其胞外結(jié)構(gòu)域與EGFR的相互作用影響EGFR的活化及下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。然而，CDH1對EGFR表達影響的研究較少。最近的一項研究表明，在頭頸癌細(xì)胞中CDH1表達下調(diào)能夠轉(zhuǎn)錄激活EGFR的表達，最終促進頭頸癌細(xì)胞的增殖。但是，在肺癌細(xì)胞中CDH1表

4、達下調(diào)影響EGFR表達的分子機制并不清楚。
　　YBX1作為一種癌蛋白不僅在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中過表達而且作為肺癌進展的標(biāo)志性分子受到人們的廣泛關(guān)注。研究表明，YBX1與EGFR的表達調(diào)控密切相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞中，YBX1能夠與EGFR的啟動子直接結(jié)合進而促進EGFR的轉(zhuǎn)錄表達，而這一表達調(diào)控依賴于YBX1S102的磷酸化。AKT作為絲氨酸蘇氨酸激酶能夠磷酸化YBX1第102位絲氨酸，使YBX1發(fā)生核轉(zhuǎn)位進而促進其行使轉(zhuǎn)錄

5、因子的功能。以上研究報道提示我們CDH1表達下調(diào)所引起的EGFR表達上調(diào)可能通過AKT信號通路活化YBX1進而調(diào)控EGFR的表達。
　　DIRAS3是GTP結(jié)合Ras樣蛋白，它作為腫瘤抑制基因在卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞中表達下調(diào)。同時，DIRAS3的過表達能夠削弱卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞的增殖、自噬、凋亡和遷移。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)CDH1表達下調(diào)促進乳腺癌細(xì)胞中DIRAS3的轉(zhuǎn)錄表達，但是其具體的調(diào)控機制并不清楚。
　　綜上所述，目前對

6、腫瘤細(xì)胞中CDH1調(diào)控EGFR和DIRAS3表達的精細(xì)分子機制還不清楚，因而，有必要對這一問題進行研究。在本論文中我們利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，研究腫瘤細(xì)胞中CDH1調(diào)控EGFR和DIRAS3表達的分子機制以及功能機制，期望以此了解腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中關(guān)鍵分子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為開發(fā)具有高度特異性、更加高效的抗腫瘤藥物提供新的靶標(biāo)和腫瘤治療策略。
　　研究內(nèi)容及研究成果：
　　1.CDH1表達下調(diào)誘導(dǎo)EGFR表達的分子機制研

7、究
　　在人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中，利用siRNA干擾抑制CDH1的表達或通過病毒感染穩(wěn)定沉默CDH1的表達發(fā)現(xiàn)，短期或長期沉默CDH1都能夠上調(diào)EGFR的表達。并且，瞬時過表達CDH1或通過病毒感染穩(wěn)定表達CDH1后，EGFR的表達水平明顯降低。進一步的RT-PCR結(jié)果顯示，抑制CDH1的表達能夠顯著上調(diào)EGFR轉(zhuǎn)錄水平的表達。從而表明CDH1表達下調(diào)在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)EGFR的表達。隨后探究轉(zhuǎn)錄因子YBX1是否參與CDH1調(diào)控EGF

8、R表達的過程。在穩(wěn)定抑制CDH1表達的A549shCDH1和H1650shCDH1細(xì)胞中檢測p-YBX1的水平，發(fā)現(xiàn)YBX1的磷酸化水平升高。并且，瞬時過表達CDH1或通過病毒感染穩(wěn)定表達CDH1后，YBX1的磷酸化水平降低，表明CDH1表達下調(diào)能夠激活YBX1。為了進一步檢測CDH1表達下調(diào)所引起的EGFR表達上調(diào)是否依賴于YBX1的活化，我們利用siRNA干擾技術(shù)抑制CDH1表達的同時沉默YBX1的表達，發(fā)現(xiàn)抑制YBX1的表達能夠削

9、弱由CDH1沉默所引起的EGFR的表達上調(diào)。這些實驗數(shù)據(jù)表明，CDH1表達下調(diào)所誘導(dǎo)的EGFR的表達依賴于轉(zhuǎn)錄因子YBX1的激活。接下來的實驗進一步探究磷酸化的YBX1能否直接結(jié)合到EGFR啟動子上調(diào)控EGFR的表達。利用包含不同突變形式的EGFR1kb啟動子的熒光素酶報告質(zhì)粒進行實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型的EGFR啟動子相比，1b和2a兩個YRE位點的突變削弱了由CDH1沉默所引起的EGFR啟動子的活性的增強。同時，利用YBX1的相應(yīng)抗體進行

10、ChIP實驗，結(jié)果顯示沉默CDH1表達后，YBX1與EGFR啟動子區(qū)的結(jié)合明顯增加。以上實驗表明，在人的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中抑制CDH1的表達能夠磷酸化YBX1，并且通過引起YBX1與EGFR啟動子區(qū)結(jié)合的增加上調(diào)EGFR的轉(zhuǎn)錄表達。
　　研究表明AKT信號通路能夠誘導(dǎo)YBX1第102位絲氨酸的磷酸化，使其發(fā)生核轉(zhuǎn)位進而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達。但是CDH1表達下調(diào)能否激活A(yù)KT信號通路并不清楚。在穩(wěn)定抑制CDH1表達的A549shCDH

11、1和H1650shCDH1細(xì)胞中檢測p-AKT的水平發(fā)現(xiàn)與對照細(xì)胞相比AKT的磷酸化水平升高。并且，瞬時過表達CDH1或通過病毒感染穩(wěn)定表達CDH1后，AKT的磷酸化水平降低，表明CDH1表達下調(diào)能夠激活A(yù)KT信號通路。為了進一步確定AKT信號通路在CDH1表達下調(diào)所引起的YBX1誘導(dǎo)EGFR表達中的作用，我們利用siRNA干擾技術(shù)抑制AKT的表達后發(fā)現(xiàn)，YBX1的磷酸化水平明顯降低并且伴隨著EGFR表達的下調(diào)。
　　綜上所述，C

12、DH1表達下調(diào)能夠激活A(yù)KT信號通路進而磷酸化YBX1，最終上調(diào)EGFR的表達。
　　2.CDH1表達下調(diào)誘導(dǎo)EGFR表達的功能研究
　　EGFR作為受體酪氨酸蛋白激酶家族的重要成員，在胞外信號向胞內(nèi)傳遞的過程中發(fā)揮重要作用。EGFR受體過表達時，能夠?qū)е翬GFR配體非依賴的激活。而CDH1表達下調(diào)能夠誘導(dǎo)EGFR蛋白水平的表達，因此我們檢測CDH1表達下調(diào)后EGFR下游信號通路的活化情況。實驗發(fā)現(xiàn)不管短時沉默CDH1的表達

13、(12h和24h)，還是長時抑制CDH1的表達(72h)，都能夠活化c-Jun、ERK和Src，激活EGFR下游信號通路。
　　利用siRNA干擾技術(shù)抑制CDH1的表達或通過病毒感染穩(wěn)定沉默CDH1表達后，一方面進行細(xì)胞增殖實驗，發(fā)現(xiàn)抑制CDH1的表達能夠顯著增強肺癌細(xì)胞的增殖;另一方面進行細(xì)胞劃痕實驗和細(xì)胞侵襲實驗，發(fā)現(xiàn)CDH1表達下調(diào)能夠促進肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。我們的數(shù)據(jù)表明，CDH1表達下調(diào)也許通過調(diào)控YBX1和EGFR促

14、進腫瘤進展和轉(zhuǎn)移。因此，我們進一步探究靶向抑制YBX1和EGFR的表達對CDH1表達下調(diào)所引起的肺癌細(xì)胞的高增殖和高轉(zhuǎn)移能力的影響。在肺癌細(xì)胞中抑制CDH1表達的同時，分別抑制YBX1和EGFR的表達。通過細(xì)胞增殖實驗，細(xì)胞劃痕實驗和細(xì)胞侵襲實驗發(fā)現(xiàn)，沉默YBX1和EGFR的表達能夠削弱CDH1下調(diào)所引起的肺癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲能力的增強。并且，在穩(wěn)定抑制CDH1表達的A549shCDH1細(xì)胞中進行相同的實驗，我們得到了相同的實驗結(jié)果

15、。
　　3.CDH1表達下調(diào)誘導(dǎo)DIRAS3表達的分子機制研究
　　沉默CDH1的表達后進行基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，CDH1表達下調(diào)促進DIRAS3基因的轉(zhuǎn)錄表達。為了驗證這一發(fā)現(xiàn)，我們在MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CDH1siRNA，RT-PCR結(jié)果顯示MCF7細(xì)胞中沉默CDH1的表達可以顯著上調(diào)DIRAS3轉(zhuǎn)錄水平的表達。基于CDH1通過YBX1調(diào)控EGFR的實驗結(jié)果，我們推測在MCF7細(xì)胞中CDH1表達下調(diào)是否同樣通過激活轉(zhuǎn)錄因子YB

16、X1調(diào)控DIRAS3的表達。首先，在MCF7細(xì)胞中沉默CDH1的表達后，檢測發(fā)現(xiàn)YBX1的磷酸化水平和DIRAS3的表達明顯增加。隨后，在MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞中過表達YBX1，發(fā)現(xiàn)YBX1過表達能夠增加DIRAS3轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達。同時，抑制MCF7和MDA-MB-231細(xì)胞中YBX1的表達能夠降低DIRAS3的表達。這些實驗數(shù)據(jù)表明，CDH1表達下調(diào)所誘導(dǎo)的DIRAS3的表達上調(diào)依賴于轉(zhuǎn)錄因子YBX1。
　

17、　接下來，進一步探究YBX1作為轉(zhuǎn)錄因子能否與DIRAS3的啟動子結(jié)合。利用YBX1的相應(yīng)抗體進行ChIP實驗發(fā)現(xiàn)，加入YBX1抗體的實驗組中YBX1與DIRAS3啟動子區(qū)YREs的結(jié)合明顯增加。隨后，在MCF7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CDH1siRNA12小時后進行ChIP實驗。結(jié)果顯示沉默CDH1表達后，YBX1與DIRAS3啟動子區(qū)3個YREs位點的結(jié)合增加，分別是-218-360，-809-907和-984-1173。以上數(shù)據(jù)表明，在乳腺癌細(xì)

18、胞中抑制CDH1的表達能夠磷酸化YBX1，并且能夠引起YBX1與DIRAS3啟動子區(qū)結(jié)合的增加進而上調(diào)DIRAS3的轉(zhuǎn)錄表達。
　　綜上所述，在乳腺癌細(xì)胞中，CDH1表達下調(diào)能夠激活轉(zhuǎn)錄因子YBX1，進而上調(diào)DIRAS3的轉(zhuǎn)錄表達。
　　結(jié)論：
　　1.在肺癌細(xì)胞中，CDH1表達下調(diào)能夠激活A(yù)KT信號通路進而磷酸化YBX1，最終在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)EGFR的表達。
　　2.CDH1表達下調(diào)引起EGFR表達增加后激活EG

19、FR下游信號通路，并且CDH1表達下調(diào)能夠促進肺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。
　　3.靶向抑制YBX1和EGFR能夠削弱CDH1表達下調(diào)所引起的肺癌細(xì)胞的高增殖和高轉(zhuǎn)移能力。
　　4.在乳腺癌細(xì)胞中，CDH1表達下調(diào)能夠激活轉(zhuǎn)錄因子YBX1，進而上調(diào)DIRAS3的表達。
　　第二部分，SUV39H1抑制劑誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡的分子機制
　　研究目的：
　　癌癥已成為世界范圍內(nèi)最主要的致死疾病之一，近30年來我國的癌癥發(fā)

20、展極為迅速，這與表觀遺傳調(diào)控密切相關(guān)，因此開發(fā)有效地表觀遺傳藥物用于腫瘤治療成為當(dāng)前的研究熱點。然而基于表觀遺傳學(xué)調(diào)控的另一種重要調(diào)控方式——組蛋白甲基化修飾的藥物研究剛剛起步，因此，深入探討組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV39H1抑制劑的抗腫瘤分子機制，對相關(guān)藥物的開發(fā)具有重要的戰(zhàn)略意義。
　　我們以組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SUV3H1的抑制劑chaetocin為研究工具，深入探討組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的分子機制，以期為組蛋白甲基

21、轉(zhuǎn)移酶抑制劑的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)；
　　2.SRB實驗檢測腫瘤細(xì)胞存活率；
　　3.WesternBlot檢測細(xì)胞內(nèi)蛋白的表達；
　　4.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；
　　5.siRNA干擾相關(guān)基因的表達。
　　研究成果：
　　1.chaetocin能夠誘導(dǎo)多種非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡；
　　2.chaetocin能夠誘導(dǎo)死亡受體DR5的表達；

22、>　　3.抑制DR5的表達能夠降低chaetocin誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡；
　　4.chaetocin通過CHOP上調(diào)DR5的表達；
　　5.chaetocin激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；
　　6.chaetocin上調(diào)ATF3的表達后誘導(dǎo)DR5依賴的細(xì)胞凋亡；
　　7.抑制SUV39H1誘導(dǎo)ATF3和CHOP表達以及DR5依賴的細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：
　　1.chaetocin誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡；
　

23、　2.chaetocin以DR5依賴的方式誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；
　　3.chaetocin激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激上調(diào)ATF3和CHOP的表達進而誘導(dǎo)DR5依賴的細(xì)胞凋亡；
　　4.沉默SUV39H1上調(diào)ATF3和CHOP的表達進而誘導(dǎo)DR5依賴的細(xì)胞凋亡。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SUV39H1的抑制劑chaetocin能夠誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡。并且提出組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的分子機制:組蛋白甲基轉(zhuǎn)