PTEN在鋁毒性實驗性阿爾茨海默病小鼠模型發(fā)生發(fā)展中的變化.pdf

1、目的： 在鋁毒性擬阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)小鼠模型上，以小鼠學習記憶障礙以及腦組織出現(xiàn)老年斑(SP)及神經(jīng)原纖維纏結(NFT)等AD特征性病理變化為指標反映AD樣進展程度，從小鼠海馬等腦組織中PTEN蛋白以及磷酸化PTEN蛋白水平、PTEN mRNA水平、PTEN樣免疫陽性反應物表達與分布等研究層次，探索PTEN在AD樣誘導發(fā)生發(fā)展過程中的動態(tài)變化及其與AD的關聯(lián)，以深化理解AD發(fā)病機制，為A

2、D的防治提供新的途徑，為抗AD新藥研發(fā)提供新的藥物作用靶點。 方法： ①采用小鼠側腦室注射0.5％A1Cl3溶液2μl，每天1次，連續(xù)5 d誘導出實驗性AD模型，對照組注射等量的人工腦脊液； ②末次側腦室注射后第2天、第7天采用避暗試驗，第23～30天采用Morris水迷宮試驗檢測模型小鼠學習記憶能力； ③上述3個時間點行為學試驗結束后，隨即采用改良的硫磺素染色技術(Modified thioflavin

3、e S techniques，MTST)檢測小鼠海馬等腦組織內(nèi)SP和。NFT等形成情況，RT-PCR測定小鼠海馬組織內(nèi)PTEN mRNA水平，Western blotting法測定其PTEN蛋白和磷酸化PTEN蛋白水平； ④同上方案制作另一批鋁毒性擬AD小鼠模型，分別于末次側腦室注射后第7、14、21、28、35天，以免疫組織化學法觀測PTEN樣免疫陽性反應物在小鼠海馬等腦組織內(nèi)的表達與分布。 結果： 1.鋁毒性

4、實驗性AD小鼠模型的建立： ①上述末次側腦室注射后第2天，模型組小鼠相比對照組逃避潛伏期和錯誤次數(shù)未見明顯差異； ②側腦室注射后第7天，對照組小鼠逃避潛伏期較第2天顯著延長(P<0.001)，錯誤次數(shù)減少；而模型組小鼠潛伏期未見明顯變化，錯誤次數(shù)增加，雙因素統(tǒng)計分析顯示模型組小鼠逃避記憶能力隨時間進行受鋁毒的影響顯著下降(鋁毒處理和時間交互作用，P<0.05)； ③側腦室注射后第23～30天，在Morris水迷宮

5、試驗中，模型組小鼠定向航行平均成績顯著低于對照組(P<0.001)，空間探索目標象限滯留時間顯著低于對照組(P<0.05)，表明模型組小鼠空間學習記憶能力顯著受損； ④在上述3個時間點行為學試驗結束后，每組立即取2～3只小鼠斷頭取腦，MTST染色可見于側腦室注射后第30天模型組小鼠大腦顳區(qū)皮質(zhì)有老年斑和神經(jīng)原纖維纏結類似結構。 2.鋁毒性擬AD小鼠海馬組織中PTEN mRNA水平的變化：在上述3個時間點行為學試驗結束后，

6、每組立即取4～5只小鼠斷頭取腦，分離全海馬并提取總RNA，行RT-PCR測定海馬組織中PTEN mRNA水平，結果顯示第2、7天模型組與對照組無明顯差異，第30天模型組mRNA水平顯著低于對照組(P<0.05，1-tailed)。 3.鋁毒性擬AD小鼠海馬組織中PTEN蛋白和磷酸化PTEN蛋白水平的變化：在上述3個時間點行為學試驗結束后，每組立即取4～5只小鼠斷頭取腦，分離全海馬行 ①Western blotting測定

7、海馬組織PTEN蛋白水平，結果見上述3個時間點模型組均略高于對照組，但無顯著差異； ②Western blotting測定海馬組織中磷酸化PTEN-Ser380蛋白水平，側腦室注射后第2、7天模型組與對照組未見明顯差異，第30天模型組磷酸化PTEN-Ser380蛋白水平顯著低于對照組(P<0.05)。 4.鋁毒性擬AD小鼠發(fā)生發(fā)展過程中腦組織PTEN樣免疫陽性反應物表達與分布的變化狀況： ①海馬組織：鏡下觀察可見

8、，PTEN樣免疫陽性反應物在小鼠海馬CAl、CA2、CA3錐體層細胞及齒狀回顆粒細胞存在高豐度表達；上述側腦室末次注射后第7、14、21、28、35天，模型組小鼠海馬CAl區(qū)錐體層神經(jīng)元內(nèi)PTEN樣免疫陽性反應強度相比對照組存在變化，而在CA2、CA3區(qū)錐體層細胞及齒狀回顆粒細胞未見明顯變化。以免疫組化專用分析軟件選擇測定CAl區(qū)錐體層灰度值，結果表明，側腦室末次注射后第7天模型組小鼠海馬CAl區(qū)錐體神經(jīng)元PTEN樣免疫陽性反應強度顯著

9、高于對照組(﹡﹡P<0.01)；第14天仍高于對照組(*P<0.05)；第21、28天與對照組相比無顯著差異；第35天顯著低于對照組(*P<0.05)。 ②大腦皮質(zhì)組織：鏡下觀察可見，PTEN樣免疫陽性反應物在大腦皮質(zhì)錐體神經(jīng)元高豐度表達，顆粒層及多形細胞層弱陽性表達。上述側腦室末次注射后第7、14、21、28、35天，模型組小鼠大腦皮質(zhì)顳區(qū)第Ⅲ層錐體神經(jīng)元PTEN樣免疫陽性反應強度相比對照組存在變化。以免疫組化專用分析軟件選擇

10、測定大腦皮質(zhì)顳區(qū)第山層錐體神經(jīng)元灰度值，結果顯示，模型組小鼠大腦皮質(zhì)顳區(qū)第Ⅲ層錐體神經(jīng)元PTEN樣免疫陽性反應強度呈階段性變化，側腦室末次注射后第7天模型組和對照組比較無顯著差異；第14天模型組顯著強于對照組(﹡﹡P<0.01)；第21、28和35天模型組均顯著弱于對照組(﹡P<0.05)。 結論： 1.側腦室注射 A1C13可致小鼠學習記憶能力顯著受損，大腦顳區(qū)皮質(zhì)在模型發(fā)展的后期可出現(xiàn)SPs和NFTs，提示鋁毒性小鼠