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文檔簡介
1、目的: 探討乙肝病毒X蛋白能否激活MLK3-MKK7-JNK信號模塊,從而活化Fas/FasL死亡受體信號通路誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡。
方法: 采用分子生物學(xué)的方法構(gòu)建靶向HBX的shRNA表達(dá)載體pSilencer3.1-shHBX,通過雙酶切鑒定后,選出陽性克隆進(jìn)行DNA測序。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將HBx的表達(dá)載體pcDNA3.1-X轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞建立HBX的高表達(dá)模型(pcDNA3.1-X組),將pSilencer3
2、.1-shHBX與pcDNA3.1-X按3:1共轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞建立干擾HBX表達(dá)的細(xì)胞模型(RNAi組),同時設(shè)立只轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載質(zhì)粒的HepG2細(xì)胞對照(HepG2組)和以通用陰性對照質(zhì)粒代替pSilencer3.1-shHBX的陰性對照(陰性對照組)。轉(zhuǎn)染72小時后,分別以RT-PCR、Western blot和細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測HBX的表達(dá)量。流式細(xì)胞儀、Tunel染色和Hochest33258染色檢測細(xì)胞的凋亡
3、情況。同時采用Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)檢測MLK3-MKK7-JNK信號模塊及Fas-L, Bax,p-Bcl-2蛋白的表達(dá)情況,分光光度法檢測caspase3,caspase8的活性。
結(jié)果:
1、重組干擾質(zhì)粒即表達(dá)載體pSilencer3.1-shHBX測序鑒定結(jié)果與質(zhì)粒的設(shè)計序列一致。
2、與HepG2細(xì)胞組相比,在pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組和陰性對照組中,Western
4、blot檢測顯示MLK3、MKK7、JNKs磷酸化水平明顯增加(P<0.05),F(xiàn)as-L蛋白相對表達(dá)量亦增加(P<0.05);而在RNAi模型中上述蛋白指標(biāo)均降低,與pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組和陰性對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
3、分光光度法檢測結(jié)果顯示,與HepG2細(xì)胞組相比,在pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組和陰性對照組中, caspase8 , caspase3 酶活性增強( P<0.05 );而
5、在RNAi 模型中,caspase8,caspase3酶活性減弱,且與pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組和陰性對照相比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
4、經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)等方法檢測結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞凋亡率在pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組中較HepG2細(xì)胞組顯著增加(P<0.05);而在RNAi模型中,細(xì)胞凋亡率下降,且與pcDNA3.1-X 轉(zhuǎn)染組和陰性對照組相比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
結(jié)論
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